ช่วงค่า pH ทางสรีรวิทยาที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ในไบโอรีแอคเตอร์สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์
เหตุใดช่วงค่า pH 7.2–7.4 จึงช่วยปกป้องความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์และเพิ่มประสิทธิภาพการดูดซึมรวมทั้งปฏิกิริยาเชิงพลศาสตร์
ผลผลิตของเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในไบโอรีแอคเตอร์สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ขึ้นอยู่กับการจำกัดค่า pH ภายนอกเซลล์ให้อยู่ในช่วงแคบ ๆ ที่ 7.2–7.4 ช่วงนี้เป็นช่วงค่า pH ที่สมดุลสำหรับเสาหลักทางชีววิทยา 3 ประการ ได้แก่
ก. พลศาสตร์ของเอนไซม์: เอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการเมแทบอลิซึมได้รับผลกระทบจากกระจายตัวของประจุในช่วงค่า pH ที่ไวต่อการเปลี่ยนแปลง เอนไซม์อาจสูญเสียกิจกรรมลงได้มากถึง 40–60% เนื่องจากการเปลี่ยนรูปร่างโครงสร้างตามช่วงค่า pH
ข. ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์: ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์จะถูกคงไว้ภายในช่วงแคบ ๆ เนื่องจากแรงดันไฟฟ้าเคมีและสมดุลออสโมติกของระบบการขนส่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ การเบี่ยงเบนออกจากช่วงนี้จะก่อให้เกิดการฉีกขาดของเยื่อหุ้มเซลล์
ค. การขนส่งสารอาหาร: การขนส่งกรดอะมิโนเข้าสู่เซลล์ โดยเฉพาะกรดอะมิโนจำเป็นที่มีโครงสร้างกิ่ง (branched-chain amino acids) ลดลงอย่างมาก จนทำให้สารตั้งต้นหลักสำหรับกระบวนการสังเคราะห์ชีวภาพหมดสิ้น และการเจริญเติบโตของเซลล์ชะลอตัว
สายพันธุ์เซลล์ CHO และ HEK293 มีความไวเป็นพิเศษ โดยการเปลี่ยนแปลงค่า pH เพียงเล็กน้อยเพียง 0.3 หน่วย ก็สามารถกระตุ้นให้เกิดการเขียนโปรแกรมใหม่ของเส้นทางเมแทบอลิซึมในเซลล์อย่างไม่สามารถย้อนกลับได้ ซึ่งได้รับการยืนยันแล้วด้วยการวิเคราะห์โปรไฟล์การแสดงออกของยีน (transcriptional profiling) และการวิเคราะห์สมดุลกระแสเมแทบอลิซึม (flux balance analysis) (Nature Biotechnology, 2021)
ผลกระทบต่อความสามารถในการมีชีวิตรอด ช่วงค่า pH และบทบาทของค่า pH ในไบโอเรแอคเตอร์
การเจริญเติบโตเชิงลบและการสูญเสียความสามารถในการมีชีวิตรอดในทุกวัฒนธรรมของ HEK293 และ CHO ภายใต้การเบี่ยงเบนค่า pH อย่างต่อเนื่อง
ความไม่สมดุลของค่า pH ที่คงอยู่ในวัฒนธรรมเซลล์ CHO ซึ่งพบได้ทั่วไปตามมาตรฐานอุตสาหกรรมไบโอเรแอคเตอร์ ส่งผลให้เกิด:
- สูญเสียความสามารถในการมีชีวิตรอด 40% เนื่องจากการแตกตัวของดีเอ็นเอผ่านโปรตีน p53 ที่เกิดจากสภาวะกรด และการเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ p53
- การผลิตกรดเพิ่มขึ้น 200% เนื่องจากแลคเตท ซึ่งส่งเสริมการเกิดสภาวะกรดอย่างเข้มข้นยิ่งขึ้นผ่านกลไกการควบคุมย้อนกลับ (feedback enhancement)
- การลดลงของระยะ G1 ซึ่งนำไปสู่การลดลงของปริมาณผลิตภัณฑ์ (Product Titer) ร้อยละ 50 เนื่องจากการยับยั้งการถอดรหัส (transcriptional shut down) ของโปรตีนที่ถูกสร้างขึ้นใหม่
ระบบ HEK293 ทั้งหมดเผชิญความท้าทายที่คล้ายคลึงกัน: ความแม่นยำของการไกลโคซิเลชันลดลงอย่างมากที่ pH 7.8 มีการเพิ่มขึ้นสามเท่าของโปรตีนกาลาคโตซิลทรานสเฟอเรสที่พับผิดรูป ซึ่งส่งผลกระทบเชิงลบต่อหน้าที่ของแอนติบอดีโมโนโคลนอล (mAbs) ความแปรปรวนเหล่านี้ส่งผลให้เกิดค่าใช้จ่ายเฉลี่ย 740,000 ดอลลาร์สหรัฐต่อการดำเนินการหนึ่งรอบในไบโอรีแอคเตอร์ (รายงานความเสี่ยงด้านไบโอแมนูแฟคเจอริง โดยสถาบันโปเนียน ปี 2023) ซึ่งเน้นย้ำถึงความจำเป็นในการควบคุมค่า pH ในการผลิตชีวภาพในระดับที่สามารถขยายขนาดได้และสอดคล้องตามข้อกำหนด
แหล่งที่มาของความไม่เสถียรทางเมแทบอลิซึม
การสะสมของ CO₂ และระบบบัฟเฟอร์ในไบโอรีแอคเตอร์แบบพ่นอากาศ (Sparged Bioreactors)
ในระหว่างกระบวนการหายใจของเซลล์ จะมีการผลิต CO₂ ซึ่งทำปฏิกิริยากับ H₂O สร้างกรดคาร์บอนิก (H₂CO₃) ซึ่งจะแยกตัวบางส่วนออกเป็น H⁺ และ HCO₃⁻ ร่างกายมีกลไกการควบคุมสมดุลแบบไบคาร์บอเนตโดยธรรมชาติ (CO₂ + H₂O ↔ H₂CO₃ ↔ H⁺ + HCO₃⁻) ที่ช่วยรักษาสมดุลของระบบไว้ แต่กลไกนี้จะล้มเหลวอย่างรวดเร็ว โดยเฉพาะเมื่ออัตราการเผาผลาญสูงมาก ตัวอย่างเช่น ไบโอรีแอคเตอร์แบบพัดลม (sparged bioreactors) ในระบบนี้ การไหลของก๊าซในไบโอรีแอคเตอร์ที่ไม่เหมาะสมอาจทำให้เกิดความเข้มข้นของ CO₂ สูงเกิน 120 mM ซึ่งจะส่งผลให้ค่า pH ลดลงอย่างมีนัยสำคัญถึงครึ่งหนึ่งถึงหนึ่งหน่วย บริเวณที่มีความเข้มข้นของ CO₂ สูงแม้เพียงเล็กน้อยนี้จะก่อให้เกิดปัญหาต่าง ๆ เช่น ความผิดปกติในการทำงานของเอนไซม์แลคเทตเดไฮโดรจีเนส (lactate dehydrogenase) และการรบกวนสมดุลของตัวแลกเปลี่ยน Na⁺/H⁺ ซึ่งเร่งกระบวนการเกิดภาวะกรดในท้องถิ่นของวัฒนธรรมเซลล์อย่างมาก
การเกิดภาวะกรดจากแลคเทต: วงจรตอบสนองย้อนกลับในการดำเนินการไบโอรีแอคเตอร์สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบความหนาแน่นสูง
เมื่อความหนาแน่นของเซลล์ที่มีชีวิตเกิน 10⁶ เซลล์/มล. จะเกิดการเพิ่มขึ้นแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลของการใช้กลูโคส และกระบวนการไกลโคไลซิสจะเป็นหลัก แม้ในสภาวะที่มีออกซิเจนอยู่ (ปรากฏการณ์ 'วาร์บวร์ก') ซึ่งนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของการผลิตแลคเตตและไอออน H⁺ จนเกิดวงจรที่เร่งตัวเอง:
การเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของไอออน H⁺ ในสารละลาย (ทำให้ค่า pH ลดลง) จะกระตุ้นปั๊มขับโปรตอนออกนอกเซลล์ (เช่น NHE1) ซึ่งส่งผลให้ ATP ถูกเบี่ยงเบนไปจากกระบวนการสังเคราะห์ชีวภาพ
ความเครียดด้านพลังงานนี้ยังกระตุ้นกระบวนการไกลโคไลซิสเพิ่มเติม ส่งผลให้เกิดการผลิตไอออน H⁺ และแลคเตตเพิ่มขึ้นอีก
ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ CHO แลคเตตจะถูกผลิตเกิน 20 มิลลิโมลาร์ภายในไม่กี่ชั่วโมง ทำให้ค่า pH ของสารละลายโดยรวมลดลงต่ำกว่า 6.8 และลดอัตราการผลิตเฉพาะ (specific productivity) ลง 35% นอกจากนี้ยังเปลี่ยนการเผาผลาญของเซลล์ให้ห่างจาก mTORC1 ส่งผลให้การแปลรหัส (translation) การพับโปรตีน และศักยภาพในการสังเคราะห์ชีวภาพโดยรวมลดลง
การพัฒนาวิธีควบคุมค่า pH สำหรับการดำเนินงานเชิงพาณิชย์ขนาดใหญ่ของไบโอรีแอคเตอร์เพื่อเพาะเลี้ยงเซลล์
การฉีด CO₂ ผ่านสารละลาย เทียบกับการเติมกรด/เบสแบบอัตโนมัติ
การฉีดก๊าซ CO₂ นั้นมีข้อดีคือสามารถลดค่า pH ได้อย่างรวดเร็ว แต่ก็มีข้อเสียบางประการเช่นกัน ได้แก่ การเกิดโฟม ความเครียดจากแรงเฉือน (shear stress) ที่เพิ่มขึ้นภายในระบบ และการเปลี่ยนแปลงชั่วคราวของระบบบัฟเฟอร์ไบคาร์บอเนต ซึ่งอาจส่งผลเสียต่อตัวรับสารที่ไวต่อค่า pH บางชนิด โดยหลักแล้ว เนื่องจากความสามารถในการควบคุมค่า pH อย่างรวดเร็ว จึงนิยมใช้ระบบการเติมกรดหรือเบสแบบอัตโนมัติมากกว่า ระบบที่ว่านี้สามารถปรับค่า pH ให้กลับสู่สภาวะปกติได้ภายในเวลาประมาณ 30 วินาที ซึ่งถือเป็นช่วงเวลาที่สำคัญมากสำหรับสายพันธุ์เซลล์บางชนิด เช่น HEK293 ทั้งนี้ ควรทราบว่าการออกแบบวิธีการจ่ายสารไทเทรนต์ (titrant) ที่ไม่เหมาะสมอาจทำให้เกิดสภาวะที่มีความเป็นกรดสูงในบริเวณท้องถิ่น ส่งผลเสียต่อความสามารถในการดำรงชีวิตของเซลล์ ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่จึงใช้เทคนิคผสมผสาน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการปรับสมดุลการใช้ก๊าซออกซิเจน โดย CO₂ มีประสิทธิภาพสูงในการปรับค่าอย่างหยาบ (coarse adjustments) ในขณะที่การไทเทรตแบบอัตโนมัติใช้สำหรับการควบคุมอย่างละเอียด (fine control)
การออกแบบใบพัดและตำแหน่งของเซนเซอร์มีผลต่อเกรเดียนต์เชิงพื้นที่ของค่า pH อย่างไร
ความชันของค่า pH ที่มีขนาด 0.3 หน่วยเป็นสิ่งที่พบได้บ่อยค่อนข้างมากบริเวณใบพัดผสมในระหว่างการผสมไม่สมบูรณ์ และสังเกตเห็นได้ชัดเป็นพิเศษเมื่อใช้เทอร์ไบน์รัสตันแบบไหลออกตามแนวรัศมี (radial-flow Rushton turbines) ใบพัดผสมแบบเอียง (pitched blade impeller) แสดงให้เห็นผ่านแบบจำลองพลศาสตร์ของของไหลเชิงคำนวณ (computational fluid dynamics models) ว่ามีประสิทธิภาพมากกว่าในการส่งเสริมการกระจายการไหลตามแกนและลดความชันลงได้ถึง 40% นอกจากนี้ยังสามารถกำจัดบริเวณที่ของไหลนิ่ง (stagnant regions) ซึ่งกรดแลคติกสามารถซึมผ่านเข้าไปได้ในช่วงเวลาที่ของไหลหยุดนิ่งเป็นเวลานานอีกด้วย ตำแหน่งของการติดตั้งเซ็นเซอร์วัดค่า pH ก็มีความสำคัญไม่แพ้กัน การติดตั้งเซ็นเซอร์ไว้ที่ผนังใกล้กับพอร์ตสำหรับการเก็บตัวอย่าง (harvesting ports) และที่ศูนย์กลางของภาชนะจะมีประสิทธิภาพมากกว่าในการเก็บข้อมูลค่า pH ระหว่างการตรวจสอบและควบคุมกระบวนการ ทั้งนี้เมื่อเปรียบเทียบกับการติดตั้งเซ็นเซอร์ที่ส่วนยอดของภาชนะหรือใกล้ใบพัดผสมมากเกินไป การรวมกันของการวางตำแหน่งเซ็นเซอร์อย่างชาญฉลาดกับการปรับความเร็วการผสมแบบเรียลไทม์นั้นมีประสิทธิภาพในการควบคุมภาวะกรดในเลือด (acidosis) ทั่วทั้งระบบ งานตีพิมพ์ปี 2022 ของนิตยสาร BioPharm International ระบุว่าแนวทางนี้มีประสิทธิภาพในการลดอัตราความล้มเหลวของแต่ละแบทช์ลงได้ถึง 22%
มีผลกระทบต่อขั้นตอนถัดไปจากการไม่ควบคุมระดับ pH ให้อยู่ในเกณฑ์ที่เหมาะสมในกระบวนการไบโอรีแอคเตอร์สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์
ผลกระทบต่อปริมาณผลิตภัณฑ์ (product titer), ระดับการเกิดอะพอพโตซิส (apoptosis) และความสม่ำเสมอของกระบวนการ
ปฏิกรณ์ชีวภาพเริ่มแสดงอาการล้มเหลวอย่างรุนแรงเมื่อระดับ pH เคลื่อนออกจากช่วงที่เหมาะสมซึ่งอยู่ระหว่าง 7.2 ถึง 7.4 ตัวอย่างเช่น หากไม่มีการปรับระดับ pH และปล่อยให้ค่าต่ำกว่า 6.8 เป็นระยะเวลาเกิน 12 ชั่วโมง จะทำให้ผลผลิตของสารลดลงประมาณ 30% ปรากฏการณ์ดังกล่าวส่งผลให้เซลล์ไม่สามารถดูดซับกลูตามีนได้เพียงพอ จึงเกิดภาวะไรโบโซมหยุดทำงาน (ribosomal stalling) ระหว่างกระบวนการแปลรหัสพันธุกรรม (translation) ตรงกันข้าม ความเป็นกรดส่วนเกินก็ไม่พึงประสงค์เช่นกัน เพราะเป็นปัจจัยหลักที่ก่อให้เกิดการตายของเซลล์ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ส่งผลให้อัตราการเกิดอะพอพโตซิส (apoptosis) ของเซลล์ CHO เพิ่มขึ้นประมาณ 20% อันเนื่องมาจากปรากฏการณ์การรั่วไหลของไซโตโครม c จากไมโทคอนเดรีย นอกจากนี้ เมื่อระดับ pH ของปฏิกรณ์ชีวภาพสูงกว่า 7.6 จะเกิดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์หลายประการ เช่น การกระตุ้นให้เกิดภาวะเครียดของไรโบโซมในระบบเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม (endoplasmic reticulum: ER) และการเปิดใช้งานเส้นทางการตอบสนองต่อโปรตีนที่ยังไม่พับตัว (unfolded-protein response: UPR) ซึ่งถือเป็นหนึ่งในประเภทของการตอบสนองของ ER ที่รุนแรงที่สุด สรุปได้ว่า สภาวะ pH ของปฏิกรณ์ชีวภาพที่อยู่นอกขอบเขตที่กำหนดจะนำไปสู่ความแปรปรวนของกระบวนการผลิตที่เพิ่มขึ้น บันทึกการผลิตแบบแบตช์ (batch records) อาจแสดงความแปรปรวนของผลผลิตสุดท้ายประมาณ 15% สำหรับกรณีที่บันทึกค่า pH มีความแปรปรวนเกิน 0.2 หน่วยจากค่าเป้าหมาย ตามแนวทาง ICH Q5A(R2) ความแปรปรวนและความไม่สอดคล้องกันดังกล่าวจะทำให้ฝ่ายกิจการกำกับดูแล (regulatory affairs) เกิดความกังวลในระหว่างการตรวจสอบและรับรองโดยสำนักงานคณะกรรมการอาหารและยาสหรัฐอเมริกา (FDA) เนื่องจากคุณภาพที่สม่ำเสมอถือเป็นสิ่งสำคัญยิ่งยวดในอุตสาหกรรมยา
ผลกระทบจากการเปลี่ยนแปลงระดับ pH ต่อคุณลักษณะคุณภาพของแอนติบอดีแบบโมโนโคลนัล และการเปลี่ยนแปลงรูปแบบของการไกลโคซิเลชัน
การเปลี่ยนแปลงระดับ pH ส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการดัดแปลงหลังการแปลโปรตีน หาก pH ของสิ่งแวดล้อมต่ำกว่า 7.0 กิจกรรมของเอนไซม์กาลาโตซิลทรานสเฟอเรสจะลดลงร้อยละ 40 เนื่องจากกิจกรรมของหมู่ฮิสติดีนที่ถูกโปรตอนเนตทำให้เกิดการไกลโคซิเลชันแบบไฮห์-แมนโนสเพิ่มขึ้น (ร้อยละ 18) ในแอนติบอดีแบบโมโนโคลนัล ซึ่งส่งผลให้ความสามารถในการจับกับตัวรับ Fc gamma RIIIa ลดลง ตามมาด้วยการลดลงของกิจกรรมการทำลายเซลล์ผ่านกลไกแอนติบอดี (antibody-dependent cellular cytotoxicity) ในทางกลับกัน เมื่อระดับ pH สูงกว่า 7.5 จะเกิดการนำส่งเอนไซม์ไซแอลิลทรานสเฟอเรสผิดเป้าหมาย ส่งผลให้กรดไซแอลิกถูกย่อยสลายก่อนวัยอันควร ผลรวมที่ได้คือผลิตภัณฑ์มีการไซแอลิเลตไม่เพียงพอ และถูกกำจัดออกจากระบบไหลเวียนในร่างกายได้เร็วกว่าปกติหลังการบริหารเข้าสู่ร่างกาย ความแปรผันทั้งหมดด้านคุณภาพนี้ล้วนมีผลกระทบต่อคุณลักษณะคุณภาพหลักที่ผู้ผลิตจำเป็นต้องตรวจสอบและควบคุมอย่างใกล้ชิด
ลดความสามารถในการจับกับ FcΓRIIIa ลงร้อยละ 25
การเพิ่มขึ้นสามเท่าของการเกิดอนุภาคขนาดเล็กที่มองไม่เห็นด้วยตาเปล่า (subvisible particulates) และการรวมตัวกันของโมเลกุล (aggregation)
ลดลงสูงสุดถึง 40% ของครึ่งชีวิตในซีรัม (serum half-life) ระหว่างการศึกษาเภสัชจลนศาสตร์ก่อนขั้นตอนการทดลองทางคลินิก (preclinical pharmacokinetic study)
ผลกระทบนี้มีความตรงไปตรงมาและเกี่ยวข้องโดยตรงกับประสิทธิผลทางคลินิก ผลลัพธ์ที่เกิดกับผู้ป่วย และเส้นทางการอนุมัติจากหน่วยงานกำกับดูแล ซึ่งเป็นพื้นฐานในการควบคุมค่า pH ให้เป็นพารามิเตอร์กระบวนการที่สำคัญ (Critical Process Parameter: CPP) ตามแนวทาง ICH Q5 และ Q8
คำถามที่พบบ่อย
ความสำคัญของการรักษาค่า pH ในไบโอเรแอคเตอร์สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์คืออะไร
เพื่อให้การเพาะเลี้ยงเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (mammalian cell culture) บรรลุผลผลิตสูงสุด ค่า pH จำเป็นต้องรักษาไว้ในช่วง 7.2–7.4 ค่า pH นี้จะช่วยให้เซลล์ดูดซึมสารอาหารได้อย่างเหมาะสม รักษาเสถียรภาพของเยื่อหุ้มเซลล์ และสนับสนุนปฏิกิริยาของเอนไซม์ให้ดำเนินไปอย่างถูกต้อง
ค่า pH ของไบโอเรแอคเตอร์ส่งผลต่อคุณภาพของผลิตภัณฑ์โดยรวมอย่างไร
การเปลี่ยนแปลงค่า pH จะส่งผลกระทบเชิงลบต่อการผลิตชีวเภสัชภัณฑ์ที่ต้องการ และก่อให้เกิดความแปรปรวนในกระบวนการไกลโคซิเลชัน (glycosylation) ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ (cell viability) และเส้นทางการเผาผลาญ (metabolic pathways) ความแปรปรวนดังกล่าวจะส่งผลเชิงลบต่อทั้งผลผลิต คุณภาพ และผลลัพธ์โดยรวมของกระบวนการ
ใช้วิธีใดบ้างในการควบคุมค่า pH ในไบโอรีแอคเตอร์
วิธีการควบคุมค่า pH ได้แก่ การผ่านก๊าซ CO₂ เข้าไปในสารละลาย (CO₂ sparging), การเติมกรดหรือเบสโดยอัตโนมัติ และการผสมผสานระหว่างการออกแบบใบพัดที่มีประสิทธิภาพสูงขึ้นกับการจัดวางเซ็นเซอร์ให้เหมาะสมเพื่อปรับปรุงสภาวะการทำงานและลดจำนวนครั้งที่เกิดความล้มเหลวของแต่ละรอบการผลิต