نطاق درجة الحموضة الفسيولوجية المثلى لنمو الخلايا في أجهزة التخمير المخصصة لزراعة الخلايا
لماذا يحمي نطاق درجة الحموضة (pH) 7.2–7.4 سلامة الغشاء الخلوي ويحسّن امتصاص المواد والكينتيكا البيوكيميائية
إن إنتاجية الخلايا الثديية في جهاز التخمير المخصص لزراعة الخلايا تتوقف على الحفاظ على درجة الحموضة (pH) خارج الخلايا ضمن مدى ضيق يتراوح بين 7.2 و7.4. ويُوازن هذا المدى درجة الحموضة (pH) استنادًا إلى ثلاثة أركان بيولوجية:
أ. كينتيكا الإنزيمات: تتأثر الإنزيمات الأيضية بتوزيع الشحنات في المدى الحساس لدرجة الحموضة (pH). ويمكن أن تنخفض نشاطية الإنزيمات بنسبة تصل إلى 40–60% بسبب التغيرات في التركيب الثلاثي الأبعاد عبر مداها الحمضي القاعدي.
ب. سلامة الغشاء: تُحفظ سلامة الغشاء ضمن نطاق ضيق بسبب التدرجات الكهروكيميائية والتوازن الأسموزي لمنظومة نقل الغشاء. وتؤدي الانحرافات عن هذا النطاق إلى تمزق الغشاء.
ج. نقل المغذيات: ينخفض نقل الأحماض الأمينية إلى داخل الخلايا، وبخاصة الأحماض الأمينية المتفرعة الأساسية، إلى درجةٍ كبيرةٍ تؤدي إلى استنفاد السلفات الحيوية الأولية الضرورية للتخليق الحيوي، مما يُبطئ نمو الخلايا.
وتتميّز خطوط الخلايا CHO وHEK293 بحساسيةٍ بالغة، حيث يؤدي أدنى انحراف في قيمة الأس الهيدروجيني بمقدار ٠,٣ وحدةٍ إلى إعادة برمجةٍ لا رجوع فيها لمسارات التمثيل الغذائي الخلوي، كما أُثبت ذلك من خلال التحليل النسخي وتحليل توازن التدفق (Nature Biotech، ٢٠٢١).
التأثير على الحيوية، ومدى قيم الأس الهيدروجيني، والدور الذي يلعبه الأس الهيدروجيني في المفاعلات الحيوية
النمو السلبي وفقدان الحيوية في جميع زراعات HEK293 وCHO تحت ظروف انحراف ثابت في قيمة الأس الهيدروجيني
إن اختلال توازن الأس الهيدروجيني المستمر في زراعات CHO، كما هو ملاحظ في الخطوط القياسية الصناعية للمفاعلات الحيوية، يؤدي إلى:
- انخفاض بنسبة ٤٠٪ في قابلية الخلايا للبقاء بسبب تجزئة الحمض النووي لبروتين p53 الناتجة عن الحموضة وزيادة تنظيم بروتين p53
- ازدياد بنسبة ٢٠٠٪ في إنتاج الحمض نتيجة تراكم اللاكتات، ما يعزِّز التحمُّض عبر آلية تغذية راجعة مُعزَّزة
- انخفاض في المرحلة G1، ما أدى إلى انخفاض بنسبة ٥٠٪ في تركيز المنتج نتيجة إيقاف النسخ الجيني للبروتينات المعاد تكوينها
تواجه جميع أنظمة خلايا HEK293 تحديات مماثلة: فدقة التحلل السكري تنخفض بشكل حاد عند درجة حموضة ٧,٨. كما تزداد نسبة طي إنزيم جالاكتوزيل ترانسفيراز بشكل غير سليم ثلاث مرات، ما يؤثر سلبًا على الوظيفة الفاعلة للأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs). وتُقدَّر التكاليف الناتجة عن هذه التباينات بمتوسط ٧٤٠ ألف دولار أمريكي لكل دورة تشغيل في المفاعل الحيوي (معهد بونيون، تقرير مخاطر التصنيع البيولوجي، ٢٠٢٣)، مما يبرز ضرورة التحكم بدقة في درجة الحموضة خلال عمليات الإنتاج البيولوجي على نطاق واسع وبمستويات مطابقة للمعايير
مصادر عدم الاستقرار الأيضي
تراكم ثاني أكسيد الكربون ونظام التخزين العازل في المفاعلات الحيوية المُهوية
أثناء عملية التنفس الخلوي، يُنتج ثاني أكسيد الكربون (CO₂) الذي يتفاعل مع الماء (H₂O) مكونًا حمض الكربونيك (H₂CO₃)، والذي يتفكك جزئيًّا إلى أيونات الهيدروجين (H⁺) وأيونات البيكربونات (HCO₃⁻). وتوجد في الجسم آلية توازن طبيعية تعتمد على البيكربونات (CO₂ + H₂O ↔ H₂CO₃ ↔ H⁺ + HCO₃⁻) تحافظ على استقرار الحموضة، لكنها تنهار بسرعة كبيرة، لا سيما عند ارتفاع معدل الأيض بشكل ملحوظ. فعلى سبيل المثال، في المفاعلات الحيوية المُهوية (sparged bioreactors)، قد يؤدي تدفق الغاز غير الملائم في المفاعل الحيوي إلى تراكم كميات زائدة من CO₂، ما يُحدث تركيزات صغيرة تتجاوز ١٢٠ ملي مول/لتر. وهذا يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في درجة الحموضة (pH) بمقدار نصف وحدة إلى وحدة كاملة. وتؤدي هذه التجمعات الصغيرة المحلية إلى مشكلات مثل خلل في وظيفة إنزيم اللاكتات ديهيدروجينيز (lactate dehydrogenase)، واختلال في توازن نظام تبادل الصوديوم/الهيدروجين (Na⁺/H⁺ exchanger)، ما يُسرِّع بشكل كبير من عملية الحماض (acidosis) في المناطق المحلية من الثقافة الخلوية.
التحمُّض الناجم عن اللاكتات: حلقة تغذية راجعة في تشغيل المفاعلات الحيوية للثقافات الخلوية عالية الكثافة
عندما تتجاوز كثافة الخلايا الحية القابلة للحياة ١٠⁶ خلية/مل، يحدث ازدياد أسيّ في استهلاك الجلوكوز وسيادة عملية التحلل السكري، حتى في وجود الأكسجين (وهو ما يُعرف بـ«تأثير واربورغ»). ويؤدي ذلك إلى زيادة في إنتاج اللاكتات وأيونات الهيدروجين (H⁺)، مما يُحفِّز دورة ذاتية التغذية:
يؤدي الارتفاع في تركيز أيونات الهيدروجين (H⁺) في المحلول (أي انخفاض درجة الحموضة pH) إلى تفعيل مضخات طرد البروتونات (مثل مضخة NHE1)، ما يحوِّل جزءًا من طاقة ATP بعيدًا عن العمليات البيوسنتية.
وهذا الإجهاد الطاقي يحفِّز بدوره التحلل السكري بشكل أكبر، ما يؤدي إلى إنتاج مزيد من أيونات الهيدروجين (H⁺) واللاكتات.
وفي زراعة خلايا CHO، يتم إنتاج اللاكتات بتركيز يتجاوز ٢٠ ملي مول/لتر خلال ساعات قليلة، ما يؤدي إلى انخفاض درجة الحموضة (pH) في المحلول الكلي إلى ما دون ٦,٨، ويقلل الإنتاجية النوعية بنسبة ٣٥٪. كما يؤدي ذلك إلى تحويل أيض الخلايا بعيدًا عن مسار mTORC1، ما يسبب انخفاضًا في الترجمة الوراثية وطي البروتين وقدرة التصنيع الحيوي العامة.
تطوير أساليب التحكم في درجة الحموضة (pH) لتشغيل أنظمة المفاعلات الحيوية لزراعة الخلايا على نطاق واسع
التنقية بالفقاعات الغازية لثاني أكسيد الكربون مقابل الجرعات الآلية للأحماض/القواعد
إن حقن غاز ثاني أكسيد الكربون (CO₂) يُعد فعّالًا في خفض درجة الحموضة (pH) بسرعة، لكنه ينطوي أيضًا على بعض السلبيات. فعلى سبيل المثال، قد يؤدي إلى تكوّن الرغوة، وزيادة الإجهاد القصي داخل النظام، وحدوث انزياح عابر في نظام التخزين المؤقت لبيكربونات الصوديوم، ما قد يؤثر سلبًا على بعض الناقلات الحساسة لدرجة الحموضة. وبشكل رئيسي، وبسبب القدرة على التحكم السريع في درجة الحموضة، تُفضَّل أنظمة إضافات الحمض أو القاعدة الآلية. وهذه الأنظمة قادرة على إعادة درجة الحموضة إلى حالتها الطبيعية خلال نحو ٣٠ ثانية، وهي فترة زمنية ذات أهمية كبيرة لبعض خطوط الخلايا مثل خلايا HEK293. ويجب التنويه إلى أن سوء تصميم طريقة توصيل المادة المُعايرة قد يؤدي إلى ظهور مناطق محلية حمضية تؤثر سلبًا على قابلية الخلايا للبقاء. وتستخدم معظم المختبرات مجموعةً من التقنيات، لا سيما لتحقيق التوازن في استهلاك الأكسجين. إذ يُعد غاز CO₂ فعّالًا في إجراء هذه التعديلات الخشنة، بينما تُستخدَم عملية التitre الآلي للتحكم الدقيق.
كيف يؤثر تصميم المحرّك الدوار وموقع المستشعر في التدرجات المكانية لدرجة الحموضة
تُعتبر التغيرات في درجة الحموضة بمقدار ٠٫٣ وحدة pH شائعة نسبيًّا حول المحرّكات الدوارة أثناء الخلط غير الكامل، وهي أكثر وضوحًا خصوصًا مع توربينات راشتون ذات التدفق الشعاعي. وتُظهر نماذج ديناميكا السوائل الحاسوبية أن المحرّك الدوار ذا الشفرات المائلة أكثر فعاليةً في تعزيز توزيع التدفق على طول المحور، وفي خفض هذه التغيرات بنسبة ٤٠٪. كما أنه يلغي المناطق الراكدة التي تتسرّب إليها حمض اللاكتيك خلال الفترات الطويلة من الوقوف. وموقع أجهزة استشعار درجة الحموضة لا يقل أهميةً عن ذلك. إذ إن وضع أجهزة الاستشعار على جدار الخزان بالقرب من منافذ الجمع، وفي مركز الخزان، يكون أكثر فعاليةً في جمع بيانات درجة الحموضة أثناء المراقبة التشغيلية مقارنةً بوضعها في الأعلى أو بالقرب الشديد من المحرّكات الدوارة. أما الجمع بين وضع أجهزة الاستشعار الذكية والتعديل الفوري لشدة الخلط فهو نهجٌ فعّالٌ للسيطرة على حالة الحماض في جميع أنحاء النظام. وذكرت مجلة «بايو فارم إنترناشيونال» في نشرتها لعام ٢٠٢٢ أن هذا النهج فعّالٌ في خفض نسبة فشل الدفعات بنسبة ٢٢٪.
توجد تأثيرات سفلية لعدم إدارة مستويات درجة الحموضة (pH) المثلى في عمليات المفاعلات الحيوية لزراعة الخلايا.
التأثير على تركيز المنتج، ومدى حدوث موت الخلايا المبرمج (الاستماتة)، وانتظام العملية.
تبدأ المفاعلات الحيوية في إظهار أعطال جسيمة عندما تنحرف مستويات الأس الهيدروجيني (pH) خارج النطاق الأمثل الذي يتراوح بين 7.2 و7.4. فعلى سبيل المثال، إذا لم يتم تعديل مستوى الأس الهيدروجيني وبقي أقل من 6.8 لمدة تزيد عن 12 ساعة، فإن محصول المنتجات سينخفض بنسبة تقارب 30%. ونتيجةً لهذه الظاهرة، لا تستطيع الخلايا امتصاص كميات كافية من الجلوتامين، ما يؤدي إلى توقف الريبوسومات أثناء عملية الترجمة. وعلى العكس من ذلك، فإن الحموضة الزائدة ليست مرغوبة أيضًا، لأنها تُعدّ عاملاً رئيسيًّا في موت الخلايا، وبخاصة أنها تؤدي إلى زيادة تصل إلى نحو 20% في حالات موت الخلايا المبرمج (الاستماتة) لدى خلايا CHO بسبب ظاهرة تسرب السيتوكروم جـ (cytochrome c) من الميتوكوندريا. علاوةً على ذلك، عند ارتفاع مستوى الأس الهيدروجيني في المفاعل الحيوي عن 7.6، تحدث العديد من الآثار غير المرغوب فيها مثل تحفيز استجابة الإجهاد في الشبكة الإندوبلازمية (ER)، وتنشيط مسار استجابة البروتين غير المطوي (UPR)، الذي يُعَدُّ أحد أسوأ أنواع استجابات الشبكة الإندوبلازمية. وباختصار، فإن انحراف مستوى الأس الهيدروجيني في المفاعل الحيوي خارج الحدود المسموح بها يؤدي إلى زيادة التباين في العملية الإنتاجية. ويمكن توقع سجلات دفعات تتضمن تباينًا بنسبة تقارب 15% في المحصول النهائي من سجلات قياس الأس الهيدروجيني التي تتجاوز تباينها 0.2 وحدة عن القيمة المستهدفة. ووفقًا لإرشادات اللجنة الدولية لتوجيهات التوافق الدوائي ICH Q5A(R2)، فإن هذا التباين وعدم الاتساق يُنبِّه إدارة الشؤون التنظيمية خلال عمليات التحقق والاعتماد من قِبل إدارة الأغذية والأدوية الأمريكية (FDA)، نظرًا لأن الثبات في الجودة يكتسب أهمية قصوى في الصناعة الدوائية.
تأثيرات التغيرات في مستويات الأس الهيدروجيني (pH) على سمات جودة الأجسام المضادة وحيدة النسل والتحولات في نمط التحليل السكري
تؤدي التغيرات في مستويات الأس الهيدروجيني (pH) إلى تغيرات في التعديلات ما بعد الترجمة للبروتينات. فإذا كان الأس الهيدروجيني (pH) للبيئة أقل من ٧٫٠، فإن نشاط إنزيم الجالاكتوزيلترانسفيراز ينخفض بنسبة ٤٠٪، وذلك بسبب نشاط بقايا الهستيدين المؤينة بالبروتون، مما يؤدي إلى زيادة نسبة التحليل السكري عالي المانيز (١٨٪) في الأجسام المضادة وحيدة النسل، وهو ما يُترجم بدوره إلى انخفاض في الارتباط بمستقبلات Fc gamma RIIIa، وبالتالي انخفاض في السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة. أما في الحالة العكسية، أي عند مستويات الأس الهيدروجيني (pH) الأعلى من ٧٫٥، فيحدث خلل في استهداف إنزيم السيليالترانسفيراز، مما يؤدي إلى تحلل مبكر لحمض السيليك. والنتيجة الصافية هي نقص في إضافات حمض السيليك للمنتجات وزيادة في سرعة إخراجها من الدورة الدموية بعد إعطائها. وكل هذه التغيرات في الجودة تؤثر على السمات الرئيسية للجودة التي يجب أن تراقبها الشركات المصنعة بدقة.
انخفاض بنسبة ٢٥٪ في الارتباط بمستقبل FcΓRIIIa
زيادة ثلاثية في تكوّن الجسيمات دون المرئية والتجمعات.
انخفاض يصل إلى ٤٠٪ في نصف عمر المصل أثناء دراسة علم الأدوية ما قبل السريرية.
ويتمثل الأثر بشكل مباشر ومرتبط بالكفاءة السريرية، ونتائج المريض، ومسارات الموافقة التنظيمية، مما يُشكّل أساسًا للتحكم في درجة الحموضة كمعلَّمة عملية حرجة (CPP) وفقًا للمبادئ التوجيهية ICH Q5 وQ8.
الأسئلة الشائعة
ما أهمية الحفاظ على مستويات درجة الحموضة في أجهزة التخمير المستخدمة لزراعة الخلايا؟
ولتحقيق أقصى إنتاجية ممكنة في زراعة الخلايا الثديية، يجب الحفاظ على درجة الحموضة ضمن النطاق ٧,٢–٧,٤. وهذه الدرجة تضمن امتصاص الخلايا للمواد الغذائية، واستقرار الغشاء الخلوي، وحدوث التفاعلات الإنزيمية بشكل سليم.
كيف تؤثر درجة الحموضة في جهاز التخمير على الجودة العامة للإنتاج؟
سيؤدي أي انحراف في درجة الحموضة إلى التأثير سلبًا على إنتاج البيولوجيا المرغوبة، مسببًا تباينًا في أنماط التحلل السكري (Glycosylation)، وحيوية الخلايا، والمسارات الأيضية. وهذا التباين سيؤثر في النهاية سلبًا على الإنتاجية، والجودة، والنتائج العامة للعملية.
ما الطرق المستخدمة للتحكم في درجة الحموضة (pH) في المفاعلات الأحيائية؟
تشمل طرق التحكم في درجة الحموضة (pH) حقن غاز ثاني أكسيد الكربون (CO₂)، والجرعات الآلية للأحماض/القواعد، ومزيجًا من تحسين تصميم المحرّك الدوار وتحسين أماكن تركيب أجهزة الاستشعار لتحسين الظروف وتقليل حالات فشل الدفعات.