Optimalni fiziološki pH prozor za rast stanica u bioreaktorima za staničnu kulturu
Zašto pH raspon od 7.27.4 štiti integritet membrane i optimizira apsorpciju i kinetiku
U slučaju da se primjenjuje metoda za utvrđivanje vrijednosti, testiranje se provodi na temelju rezultata ispitivanja. Ovaj raspon pH-a uravnotežen je za tri biološka stuba:
a. Enzimska kinetika: Na metaboličke enzime utječe raspodjela naboja u pH-osjetljivim rasponima. Aktivnost enzima može se smanjiti za 40-60% zbog strukturnih konformacijskih pomaka u različitim pH rasponima.
b. Integritet membrane: Integritet membrane održava se u uskom rasponu zbog elektrohemijskih gradijenata i osmotičke ravnoteže membranskog transportnog sustava. Odstupanja od ovog raspona izazivaju pukotine membrana.
c. Transport hranljivih tvari: Transport aminokiselina u stanice, osobito bitnih aminokiselina s razgranatim lancima, smanjuje se do te mjere da se primarni biosintetički prekursori iscrpljuju i stanica se ne može razvijati.
CHO i HEK293 ćelijske linije posebno su osjetljive, s najmanjim pomicanjem pH vrijednosti od 0,3 jedinice što izaziva nepovratno reprogramiranje staničnih metaboličkih puteva, što je potvrđeno transkripcijskim profiliranjem i analizom ravnoteže toka (Nature Biotech, 2021).
Uticaj na životno održivost, raspon pH-a i uloga pH-a u bioreaktorima
U slučaju da se ne primjenjuje primjena ovog standarda, test se provodi na temelju podataka iz članka 4. stavka 1. točke (a) Uredbe (EZ) br. 1107/2009.
U slučaju da se ne provede ispitivanje, ispitivanje se provodi u skladu s člankom 6. stavkom 2.
- 40% Gubitak životno sposobnosti zbog kiseline indukovane fragmentacije DNA p53 i p53 upregulacije
- 200% Povećanje proizvodnje kiseline zbog laktata, pojačavajući zakiseljenje s pojačanom povratnom informacijom
- Smanjenje G1- faze, što je dovelo do smanjenja titra proizvoda za 50% kao posljedica transkripcijskog isključenja rekonstituiranih proteina.
Svi HEK293 sustavi suočavaju se s sličnim izazovima: točnost glikozilacije dramatično opada na pH 7,8. Događa se trostruko povećanje nepravilnog preklapanja galaktosiltransferaze, što negativno utječe na efektorsku funkciju monoklonskih antitijela (mAbs). Ove varijacije koštaju u prosjeku 740k $ po bioreaktoru (Ponemon Institute, Biomanufacturing Risk Report, 2023), naglašavajući nužnost kontrole pH-a u bioprodukciji na skalabilnim, usklađenim razinama.
izvori nestabilnosti metabolički
U skladu s člankom 3. stavkom 2.
Tijekom procesa staničnog disanja, proizvodi se CO2 koji reagira s H2O-om, formirajući ugljičnu kiselinu (H2CO3) koja se djelomično disoziira na H+ i HCO3−. Postoji ugrađen mehanizam za buffering bikarbonata u tijelu (CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3−) koji drži stvari zajedno, ali će se prilično brzo srušiti, posebno s značajno visokim metabolizmom. Uzmimo, na primjer, bioreaktere s žbunom. U tim sustavima, prekomjeran CO2 od nepravilnog protoka bioreaktorskog plina može stvoriti male koncentracije CO2 iznad 120 mM. To će dovesti do značajnog pada pH vrijednosti za pola do jedne jedinice. Ti mali džepovi stvaraju probleme kao što su kvarovi laktačne dehidrogenaze i poremećaj ravnoteže razmjenitelja Na + / H +, što značajno ubrzava proces acidoze u lokaliziranim područjima kulture.
Laktatska kiselost: povratna petlja u bioreaktorima s visoko gustoćom stanične kulture
Kako je živopisna gustoća stanica veća od 10• stanica/ml, dolazi do eksponencijalnog povećanja potrošnje glukoze i prevladavanja glikolize, čak i u prisutnosti kisika (Warburgov učinak). To pokreće povećanje proizvodnje laktata i H+, što pokreće samo-propagirani ciklus:
Povećanje koncentracije H+ u rastvoru (smanjenje pH-a) aktivira pumpe za ekstrudiranje protona (npr. NHE1) koje odvode ATP iz biosintetičkih procesa.
Ovaj energetski stres dodatno stimulira glikolizu, što dovodi do daljnje proizvodnje H+ i laktata.
U CHO kulturama laktat se proizvodi u količini većoj od 20 mM u roku od nekoliko sati, što dovodi do pada pH-a rastopine ispod 6,8 i smanjenja specifične produktivnosti za 35%. To također pomjera metabolizam kulture od mTORC1, što dovodi do smanjenja translacije, savijanja proteina i ukupnog biosintetskog kapaciteta.
Razvoj metoda kontrole pH-a za rad u velikom obimu bioreaktorima za stanične kulture
U slučaju da se radi o ispitivanju, potrebno je utvrditi razina i razina rizika.
Uvođenje CO2 ima prednost brzog snižavanja pH vrijednosti, ali ima i nekih nedostataka. U slučaju da se ne primjenjuje primjena ovog standarda, testiranje se provodi na temelju podataka iz članka 4. stavka 2. U skladu s člankom 3. stavkom 2. točkom (a) ovog članka, primjenjuje se metoda za određivanje vrijednosti. Ovi sustavi su sposobni vratiti pH na normalne uvjete u roku od otprilike 30 sekundi, što je značajan vremenski okvir za određene stanične linije poput HEK293. Treba napomenuti da loša konstrukcija u načinu isporuke titranta može uzrokovati razvoj lokaliziranih kiselosti koje mogu negativno utjecati na životnu sposobnost stanica. Većina laboratorija koristi kombinaciju tehnika, osobito za uravnoteženje potrošnje kisika. CO2 je učinkovit za ostvarivanje tih grubih podešavanja, a automatizirano titracija za finu kontrolu.
Kako dizajn pogona i lokacija senzora utječu na gradijent pH-a u prostoru
Gradijenti od 0,3 pH jedinice relativno su česti oko rotora tijekom nepotpunog miješanja i posebno su primjetni kod rushtonskih turbina s radijalnim protokom. U računalnim modelima dinamike tekućina pokazano je da je nagnuti rotor sa lopatom učinkovitiji u promicanju raspodjele protoka duž osi i smanjenju nagibova za 40%. Također eliminiše stagnirajuće regije koje lakta prožima tijekom dugih razdoblja stajanja. Položaj pH senzora je jednako kritičan. U slučaju da se u skladu s člankom 6. stavkom 2. točkom (a) primjenjuje na plovila koja se upotrebljavaju za proizvodnju vode, to znači da se za proizvodnju vode primjenjuje posebna pravila za proizvodnju vode. Kombinacija inteligentnog smještaja senzora i podešavanja mješanja u stvarnom vremenu učinkovita je u suzbijanju acidoze u svim sustavima. BioPharm International objavio je 2022. da je ovaj pristup učinkovit u smanjenju neuspjeha serije za 22%.
U slučaju da se ne uspostavi optimalna pH razina u procesima bioreaktorskog uzgoja stanica, postoje posljedice u daljnjem toku.
Uticaj na titar proizvoda, stupanj apoptoze i redovitost procesa.
Bioreaktor počinje iskazati ozbiljne kvarove kada pH razine odstupe od optimalnog raspona od 7,2 do 7,4. Ako se, na primjer, pH razina ne mijenja i ostaje ispod 6,8 tijekom više od 12 sati, prinosi proizvoda će se smanjiti za oko 30%. Kao rezultat takvog fenomena, stanice nisu u stanju apsorbirati dovoljno glutamina, što uzrokuje ribosomno zastoj tijekom translacije. Naprotiv, višak kiselosti nije poželjan, jer je glavni uzrok smrti stanica, a posebno dovodi do povećanja apoptoze CHO stanica za oko 20% zbog fenomena mitohondrijalnog curenja citokroma c. Osim toga, kada je pH bioreaktora veći od 7, 6, pojavljuje se mnogo neželjenih učinaka kao što su pokretanje stresnog odgovora endoplazmatskog retikula (ER) i aktivacija putanja unfolded-protein odgovora (UPR), koji je jedna od najgorih vrsta ER odgovora. U skladu s člankom 3. stavkom 2. točkom (a) ovog članka, bi se za bioreaktor upotrebljavala metoda za izračun pH vrijednosti u skladu s člankom 3. točkom (a) ovog članka. U slučaju da se u skladu s člankom 6. stavkom 1. točkom (a) primjenjuje sljedeći postupak: Prema smjernicama ICH Q5A(R2), takva promjenljivost i nedosljednost upozoravaju regulatorne poslove tijekom validacije FDA-e, s obzirom na to da je dosljedna kvaliteta od najveće važnosti u farmaceutskoj industriji.
Uticaj promjena pH razine u monoklonskim antitijelima
U slučaju da se ne primjenjuje primjena ovog standarda, ispitivanje se provodi u skladu s člankom 3. stavkom 2. Ako je pH okoline ispod 7, 0, aktivnost galaktosiltransferaze će se smanjiti za 40% jer aktivnost protoniranih ostataka histidina dovodi do veće glikozilacije visoke mannoze (18%) u monoklonalnim antitijelima što rezultira manje vezivanjem na Fc gama RIIIa receptore, što posljedično U slučaju da je pH- razina veća od 7,5, pojavljuje se obrnuti scenarij. Postoji pogrešno ciljanje sialyltransferase, što rezultira ranim razgradnjom sialičke kiseline. Neto učinak je smanjenje procijenjene upotrebe proizvoda i brže uklanjanje proizvoda iz prometa nakon primjene. Sve razlike u kvaliteti utječu na ključne kvalitetske atribute koje proizvođači moraju pomno nadzirati.
25% smanjenje afiniteta za FcGRIIIIa
tri puta povećanje u formiranju podjeljivih čestica i agregacije.
Do 40% smanjenje razpolovnog vijeka u serumu tijekom prekliničke farmakokinetičke studije.
Uticaj je izravan i važan za kliničku učinkovitost, ishod kod pacijenata i put za regulatorno odobrenje, što je osnova za kontrolu pH-a kao parametra kritičnog procesa (CPP) u skladu s smjernicama ICH Q5 i Q8.
Često se javljaju pitanja
U slučaju da se primjenjuje primjena ovog standarda, primjenjuje se sljedeći postupak:
Za uzgoj stanica sisavaca, za postizanje optimalne produktivnosti, pH se mora održavati između 7,2-7,4. Ova pH vrijednost osigurava ćelijski unos hranljivih tvari, stabilnost membrane i odgovarajuće enzimske reakcije.
Kako pH bioreaktora utječe na cjelokupnu proizvodnju u pogledu kvalitete?
Proizvodnja željenog biološkog tvari negativno će se utjecati na promjene pH vrijednosti i uzrokovati varijabilnost u glikozilaciji, ćelijskoj održivosti i metaboličkim putevima. Različitost će na kraju negativno utjecati na produktivnost, kvalitetu i ukupne rezultate procesa.
Koje se metode koriste za kontrolu pH vrijednosti u bioreaktorima?
metode kontrole pH-a uključuju CO2 spajking, automatizirano doziranje kiseline/base i kombinaciju poboljšanog dizajna rotora i optimiziranog postavljanja senzora kako bi se poboljšali uvjeti i smanjili kvarovi serije.