Оптимальный физиологический диапазон pH для роста клеток в биореакторах для культивирования клеток
Почему диапазон pH 7,2–7,4 защищает целостность мембраны и оптимизирует поглощение веществ и кинетику процессов
Продуктивность млекопитающих клеток в культуральном биореакторе зависит от поддержания внеклеточного pH в узком диапазоне 7,2–7,4. Этот диапазон обеспечивает pH-баланс трёх биологических «столпов»:
а. Ферментативная кинетика: метаболические ферменты чувствительны к распределению зарядов в pH-зависимых диапазонах. Активность ферментов может снизиться на 40–60 % вследствие конформационных изменений структуры при изменении pH.
б. Целостность мембраны: Целостность мембраны поддерживается в узком диапазоне благодаря электрохимическим градиентам и осмотическому балансу системы транспорта через мембрану. Отклонения от этого диапазона вызывают разрывы мембран.
в. Транспорт питательных веществ: Транспорт аминокислот в клетки, особенно незаменимых аминокислот с разветвлённой цепью, снижается настолько значительно, что исчерпываются основные биосинтетические предшественники, и рост клеток замедляется.
Клеточные линии CHO и HEK293 особенно чувствительны: даже незначительное отклонение pH на 0,3 единицы вызывает необратимую перепрограммировку клеточных метаболических путей, что подтверждено транскриптомным профилированием и анализом баланса потоков (Nature Biotechnology, 2021).
Влияние на жизнеспособность, диапазон pH и роль pH в биореакторах
Отрицательный рост и потеря жизнеспособности во всех культурах HEK293 и CHO при постоянном отклонении pH
Постоянный дисбаланс pH в культурах CHO, наблюдаемый в стандартных промышленных линиях биореакторов, приводит к:
- 40 % снижение жизнеспособности вследствие кислотно-индуцированного фрагментирования ДНК p53 и повышения экспрессии p53
- 200 % рост продукции кислоты за счёт лактата, что усиливает закисление за счёт положительной обратной связи
- Снижение доли клеток в фазе G1, приведшее к 50 % снижению титра продукта в результате транскрипционного подавления реконструированных белков
Все системы на основе клеток HEK293 сталкиваются с аналогичными проблемами: точность гликозилирования резко падает при pH 7,8. Наблюдается трёхкратное увеличение неправильного свёртывания галактозилтрансферазы, что негативно влияет на эффекторную функцию моноклональных антител (mAbs). Эти отклонения обходятся в среднем в 740 тыс. долл. США на один цикл работы биореактора (Институт Понемона, Отчёт о рисках в биопроизводстве, 2023 г.), что подчёркивает необходимость контроля pH в биопроизводстве на масштабируемых и соответствующих нормативным требованиям уровнях
метаболические источники нестабильности
Накопление CO₂ и система буферизации в продуваемых биореакторах
В ходе клеточного дыхания выделяется CO₂, который реагирует с H₂O, образуя угольную кислоту (H₂CO₃), частично диссоциирующую на ионы H⁺ и HCO₃⁻. В организме существует встроенная бикарбонатная буферная система (CO₂ + H₂O ↔ H₂CO₃ ↔ H⁺ + HCO₃⁻), поддерживающая гомеостаз, однако она быстро разрушается, особенно при значительно повышенном уровне метаболизма. Рассмотрим, например, продуваемые биореакторы. В таких системах чрезмерное содержание CO₂, вызванное неправильно подобранным газовым потоком через биореактор, может привести к локальному повышению концентрации CO₂ свыше 120 ммоль/л. Это вызовет значительное падение pH на 0,5–1 единицу. Такие локальные участки повышенной кислотности провоцируют, в частности, нарушение функции лактатдегидрогеназы и дисбаланс работы обменника Na⁺/H⁺, что резко ускоряет развитие локального ацидоза в культуре клеток.
Кислотность, обусловленная накоплением лактата: обратная связь в процессах культивирования клеток с высокой плотностью в биореакторах
После того как плотность жизнеспособных клеток превышает 10⁶ клеток/мл, наблюдается экспоненциальный рост потребления глюкозы и преобладание гликолиза даже в присутствии кислорода («эффект Варбурга»). Это запускает увеличение выработки лактата и ионов H⁺, инициируя самоподдерживающийся цикл:
Повышение концентрации ионов H⁺ в растворе (снижение pH) активирует протонные экструзионные насосы (например, NHE1), что отвлекает АТФ от биосинтетических процессов.
Этот энергетический стресс дополнительно стимулирует гликолиз, что приводит к дальнейшему образованию ионов H⁺ и лактата.
В культурах клеток линии CHO лактат накапливается в избытке свыше 20 ммоль/л в течение нескольких часов, в результате чего pH среды падает ниже 6,8, а удельная продуктивность снижается на 35 %. Кроме того, метаболизм культуры смещается в сторону подавления mTORC1, что приводит к снижению трансляции, свёртывания белков и общей биосинтетической способности.
Разработка методов контроля pH для крупномасштабной эксплуатации биореакторов для культивирования клеток
Пропускание CO₂ через среду по сравнению с автоматизированным дозированием кислоты/щёлочи
Пропускание CO₂ действительно позволяет быстро снизить pH, однако у этого метода есть и недостатки. Образование пены, увеличение механического сдвига в системе и кратковременное нарушение буферной системы бикарбонатов могут негативно влиять на некоторые транспортеры, чувствительные к pH. В первую очередь из-за возможности быстрого регулирования pH предпочтение отдаётся автоматизированным системам дозирования кислоты или щёлочи. Такие системы способны восстановить нормальный уровень pH примерно за 30 секунд — это существенный временной интервал для некоторых клеточных линий, например HEK293. Следует отметить, что неудачное проектирование способа подачи титранта может привести к возникновению локальных участков повышенной кислотности, что негативно скажется на жизнеспособности клеток. Большинство лабораторий используют комбинацию различных методов, особенно при балансировке потребления кислорода. CO₂ эффективен для выполнения грубой коррекции, а автоматизированное титрование — для точного регулирования.
Влияние конструкции мешалки и расположения датчика на пространственные градиенты pH
Градиенты pH величиной 0,3 единицы относительно часто возникают вблизи мешалок при неполном перемешивании и особенно заметны при использовании радиальных турбин Раштона. Согласно моделям вычислительной гидродинамики, мешалка с наклонными лопастями более эффективна в обеспечении распределения потока вдоль оси и снижает градиенты на 40 %. Кроме того, она устраняет застойные зоны, в которых в течение длительных периодов присутствует молочная кислота. Расположение датчиков pH не менее критично. Установка датчиков на стенке биореактора вблизи портов отбора проб и в центре сосуда обеспечивает более эффективный сбор данных о pH в ходе эксплуатационного мониторинга по сравнению с размещением датчиков в верхней части сосуда или в непосредственной близости от мешалок. Комбинация интеллектуального размещения датчиков и корректировки интенсивности перемешивания в реальном времени эффективно предотвращает развитие ацидоза во всей системе. В публикации журнала BioPharm International за 2022 год указано, что данный подход позволяет снизить долю неудачных партий на 22 %.
Существуют побочные эффекты, связанные с отсутствием контроля оптимального уровня pH в процессах культивирования клеток в биореакторах.
Влияние на титр продукта, степень апоптоза и регулярность процесса.
Биореакторы начинают демонстрировать серьёзные сбои при отклонении значений pH за пределы оптимального диапазона 7,2–7,4. Например, если значение pH не корректируется и остаётся ниже 6,8 в течение более чем 12 часов, выход целевых продуктов снизится примерно на 30 %. В результате такого явления клетки теряют способность поглощать достаточное количество глутамина, что приводит к остановке рибосом на этапе трансляции. Напротив, избыточная кислотность также нежелательна, поскольку она является одной из основных причин гибели клеток; в частности, она вызывает приблизительно 20-процентное увеличение апоптоза клеток линии CHO вследствие утечки цитохрома c из митохондрий. Кроме того, при значении pH в биореакторе выше 7,6 возникает ряд нежелательных эффектов, например, запуск стресс-ответа эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и активация пути ответа на неправильно свёрнутые белки (UPR), который считается одним из наиболее неблагоприятных типов реакций ЭПР. Таким образом, выход pH биореактора за установленные границы приводит к повышению вариабельности процесса. В партиях с отклонениями конечного выхода на уровне около 15 % можно ожидать при отклонениях значений pH в регистрационных данных более чем на 0,2 единицы от заданного значения. Согласно руководству ICH Q5A(R2), такая вариабельность и нестабильность вызывают тревогу у отделов по регуляторным вопросам в ходе валидации FDA, поскольку обеспечение стабильного качества имеет первостепенное значение в фармацевтической промышленности.
Влияние изменений pH на качество моноклональных антител и сдвиги в паттерне гликозилирования
Изменения pH приводят к изменениям посттрансляционных модификаций белков. Если pH среды ниже 7,0, активность галактозилтрансферазы снижается на 40 %, поскольку протонированные остатки гистидина способствуют увеличению доли высокоманнозного гликозилирования (18 %) в моноклональных антителах, что, в свою очередь, приводит к снижению связывания с рецепторами Fc-γRIIIa и, как следствие, к уменьшению антителозависимой клеточной цитотоксичности. Обратная ситуация наблюдается при pH выше 7,5: происходит неправильная локализация сиалилтрансферазы, что вызывает преждевременную деградацию сиаловой кислоты. В итоге продукты недосиалилируются, а их клиренс из кровотока после введения ускоряется. Все указанные изменения качества влияют на ключевые показатели качества, которые производители должны тщательно контролировать.
снижение аффинности к FcγRIIIa на 25 %
трехкратное увеличение образования субвидимых частиц и агрегации.
Снижение периода полувыведения из сыворотки до 40 % в ходе доклинического фармакокинетического исследования.
Воздействие является прямым и имеет непосредственное значение для клинической эффективности, исходов у пациентов и путей получения регуляторного одобрения, что обосновывает контроль pH как критического параметра процесса (CPP) в соответствии с руководствами ICH Q5 и Q8.
Часто задаваемые вопросы
Какова важность поддержания уровня pH в биореакторах для культивирования клеток?
Для достижения оптимальной продуктивности при культивировании млекопитающих клеток уровень pH должен поддерживаться в диапазоне 7,2–7,4. Такой pH обеспечивает клеточное поглощение питательных веществ, стабильность мембраны и протекание ферментативных реакций в должном виде.
Как влияет уровень pH в биореакторе на общее качество производства?
Производство требуемого биологического препарата будет негативно затронуто отклонением pH, что вызовет вариабельность в гликозилировании, жизнеспособности клеток и метаболических путях. Эта вариабельность в конечном итоге негативно скажется на продуктивности, качестве и общих результатах процесса.
Какие методы используются для контроля pH в биореакторах?
методы контроля pH включают продувку CO₂, автоматическую подачу кислоты/щелочи и комбинацию усовершенствованной конструкции мешалки и оптимизированного размещения датчиков для улучшения условий и снижения количества неудачных партий.