La ventana fisiológica óptima de pH para el crecimiento celular en los biorreactores de cultivo celular
Por qué los intervalos de pH 7,2–7,4 protegen la integridad de la membrana y optimizan la absorción y la cinética
La productividad de las células de mamífero en un biorreactor de cultivo depende de la restricción del pH extracelular a un estrecho intervalo de 7,2–7,4. Este intervalo representa un equilibrio de pH para tres pilares biológicos:
a. Cinética enzimática: las enzimas metabólicas se ven afectadas por la distribución de cargas en rangos sensibles al pH. La actividad enzimática puede reducirse hasta un 40–60 % debido a cambios conformacionales estructurales a lo largo de los distintos rangos de pH.
b. Integridad de la membrana: La integridad de la membrana se mantiene dentro de un rango estrecho gracias a los gradientes electroquímicos y al equilibrio osmótico del sistema de transporte de membrana. Las desviaciones respecto a este rango provocan roturas en las membranas.
c. Transporte de nutrientes: El transporte de aminoácidos hacia el interior de las células, especialmente de aminoácidos esenciales de cadena ramificada, se reduce en tal grado que se agotan los precursores biosintéticos principales y el crecimiento celular se ve restringido.
Las líneas celulares CHO y HEK293 son particularmente sensibles, y la más mínima desviación de pH de 0,3 unidades provoca una reprogramación irreversible de las vías metabólicas celulares, tal como se ha verificado mediante análisis de perfil transcripcional y análisis de balance de flujos (Nature Biotechnology, 2021).
Impacto sobre la viabilidad, rango de pH y papel del pH en los biorreactores
Crecimiento negativo y pérdida de viabilidad en todos los cultivos de HEK293 y CHO bajo desviación constante de pH
El desequilibrio sostenido de pH en los cultivos CHO, observado en las líneas estándar de la industria de biorreactores, da lugar a:
- 40 % de pérdida de viabilidad debido a la fragmentación del ADN p53 inducida por ácido y a la sobreexpresión de p53
- Aumento del 200 % en la producción de ácido debido al lactato, lo que refuerza la acidificación mediante un retroalimentación potenciada
- Disminución de la fase G1, lo que provocó una reducción del 50 % en la concentración del producto como resultado de una interrupción transcripcional de las proteínas reconstituidas
Todos los sistemas HEK293 enfrentan desafíos similares: la precisión de la glucosilación disminuye drásticamente a pH 7,8. Existe un aumento de tres veces en el plegamiento incorrecto de la galactosiltransferasa, lo que afecta negativamente la función efectora de los anticuerpos monoclonales (mAbs). Estas variaciones suponen un costo promedio de 740 000 USD por ciclo de biorreactor (Instituto Ponemon, Informe sobre riesgos en biofabricación, 2023), lo que subraya la necesidad de un control riguroso del pH en la biofabricación a escalas industriales y conforme a normativas.
fuentes de las inestabilidades metabólicas
La acumulación de CO₂ y el sistema amortiguador de los biorreactores con aireación
Durante el proceso de respiración celular, se produce CO₂, que reacciona con H₂O formando ácido carbónico (H₂CO₃), el cual se disocia parcialmente en H⁺ y HCO₃⁻. El organismo dispone de un mecanismo tampón intrínseco basado en bicarbonato (CO₂ + H₂O ↔ H₂CO₃ ↔ H⁺ + HCO₃⁻) que mantiene la estabilidad, pero este sistema colapsa rápidamente, especialmente en presencia de un metabolismo significativamente elevado. Considérese, por ejemplo, los biorreactores con aireación forzada (sparged). En estos sistemas, un flujo de gas inadecuado en el biorreactor puede generar concentraciones locales de CO₂ superiores a 120 mM. Esto provocará una caída significativa del pH de media a una unidad. Estas pequeñas zonas de acumulación generan problemas como la disfunción de la lactato deshidrogenasa y la alteración del equilibrio del intercambiador Na⁺/H⁺, lo que acelera considerablemente el proceso de acidosis en áreas localizadas del cultivo.
Acidificación impulsada por lactato: un bucle de retroalimentación en operaciones de biorreactor con cultivos celulares de alta densidad
Cuando la densidad de células viables supera los 10⁶ células/mL, se produce un aumento exponencial en el consumo de glucosa y predomina la glucólisis, incluso en presencia de oxígeno (el «efecto Warburg»). Esto inicia un aumento en la producción de lactato y H⁺, lo que desencadena un ciclo autorreforzado:
El aumento de la concentración de H⁺ en la solución (disminución del pH) activa las bombas de extrusión de protones (por ejemplo, NHE1), lo que desvía el ATP lejos de los procesos biosintéticos.
Este estrés energético estimula aún más la glucólisis, lo que conduce a una mayor producción de H⁺ y lactato.
En cultivos de células CHO, el lactato se produce en exceso de 20 mM en cuestión de horas, lo que provoca que el pH de la solución global descienda por debajo de 6,8 y reduzca la productividad específica en un 35 %. Asimismo, esto desvía el metabolismo del cultivo lejos de mTORC1, lo que disminuye la traducción, el plegamiento proteico y la capacidad biosintética general.
Desarrollo de métodos de control del pH para la operación a gran escala de biorreactores de cultivo celular
Espumado con CO₂ frente a dosificación automática de ácido/base
La purga con CO₂ sí tiene la ventaja de reducir rápidamente el pH, pero también presenta algunos inconvenientes. La generación de espuma, el aumento del esfuerzo cortante dentro del sistema y un cambio transitorio en el sistema tampón de bicarbonato pueden afectar negativamente a ciertos transportadores sensibles al pH. Principalmente, debido al control rápido del pH, se prefieren los sistemas automatizados de dosificación de ácido o base. Estos sistemas son capaces de restablecer el pH a condiciones normales en aproximadamente 30 segundos, un plazo significativo para ciertas líneas celulares, como HEK293. Cabe señalar que un diseño deficiente en el método de administración del agente valorante puede provocar la aparición de condiciones ácidas localizadas que afecten negativamente a la viabilidad celular. La mayoría de los laboratorios utilizan una combinación de técnicas, especialmente para equilibrar el consumo de oxígeno. El CO₂ resulta eficaz para realizar estos ajustes gruesos, mientras que la valoración automática se emplea para el control fino.
Cómo el diseño del agitador y la ubicación del sensor afectan los gradientes espaciales de pH
Los gradientes de 0,3 unidades de pH son relativamente comunes alrededor de las turbinas durante una mezcla incompleta y resultan especialmente evidentes con turbinas Rushton de flujo radial. Los modelos de dinámica de fluidos computacional muestran que una turbina de paletas inclinadas es más eficaz para promover la distribución del flujo a lo largo del eje y reducir los gradientes en un 40 %. Asimismo, elimina las zonas estancadas por las que se difunde el lactato durante períodos prolongados de reposo. La ubicación de los sensores de pH es igualmente crítica: colocarlos en la pared cerca de los puertos de recolección y en el centro del recipiente resulta más eficaz para la recopilación de datos de pH durante el monitoreo operativo, comparado con su colocación en la parte superior o muy cerca de las turbinas. La combinación de una ubicación inteligente de los sensores y el ajuste en tiempo real de la agitación de mezcla es eficaz para contener la acidosis en todo el sistema. La publicación de BioPharm International de 2022 afirma que este enfoque reduce el fracaso de los lotes en un 22 %.
Existen efectos secundarios derivados de no controlar los niveles óptimos de pH en los procesos de biorreactores para cultivos celulares.
Efecto sobre el título del producto, el grado de apoptosis y la regularidad del proceso.
Los biorreactores comienzan a presentar fallos graves cuando los niveles de pH se desvían fuera del rango óptimo de 7,2 a 7,4. Por ejemplo, si el nivel de pH no se modifica y permanece por debajo de 6,8 durante más de 12 horas, los rendimientos de los productos disminuirán aproximadamente un 30 %. Como consecuencia de este fenómeno, las células no logran captar cantidades suficientes de glutamina, lo que provoca una detención ribosomal durante la traducción. Por el contrario, un exceso de acidez tampoco es deseable, ya que constituye un factor principal de muerte celular; en particular, provoca un aumento aproximado del 20 % en la apoptosis de células CHO debido al fenómeno de la fuga de citocromo c mitocondrial. Además, cuando el pH de un biorreactor supera 7,6, ocurren numerosos efectos indeseables, como la activación de la respuesta al estrés del retículo endoplásmico (RE) y la activación de la vía de respuesta a proteínas desplegadas (UPR, por sus siglas en inglés), que es uno de los tipos más graves de respuestas del RE. En resumen, condiciones de pH fuera de los límites establecidos en el biorreactor conducen a una mayor variabilidad del proceso. Se pueden esperar registros de lote con una variabilidad aproximada del 15 % en los rendimientos finales a partir de registros de pH que presenten una variabilidad superior a 0,2 unidades respecto al valor objetivo. Según las directrices ICH Q5A(R2), dicha variabilidad e inconsistencia alerta a los asuntos regulatorios durante las validaciones de la FDA, dado que la consistencia de la calidad es de suma importancia en la industria farmacéutica.
Impactos de los cambios en los niveles de pH sobre los atributos de calidad de los anticuerpos monoclonales y los cambios en el patrón de glucosilación
Los cambios en los niveles de pH provocan modificaciones postraduccionales en las proteínas. Si el pH del entorno es inferior a 7,0, la actividad de la galactosiltransferasa disminuirá un 40 %, ya que la protonación de los residuos de histidina favorece una mayor glucosilación de tipo alto-mano (18 %) en los anticuerpos monoclonales, lo que a su vez reduce la unión a los receptores Fc gamma RIIIa y, por consiguiente, disminuye la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. El escenario inverso ocurre con niveles de pH superiores a 7,5: se produce un direccionamiento erróneo de la sialiltransferasa, lo que provoca una degradación temprana del ácido siálico. El efecto neto es una sub-sialilación de los productos y una eliminación más rápida de estos de la circulación tras su administración. Todas estas variaciones de calidad afectan a los atributos clave de calidad que los fabricantes deben supervisar estrechamente.
reducción del 25 % en la afinidad por FcΓRIIIa
aumento de tres veces en la formación de partículas subvisibles y agregación.
Hasta un 40 % de reducción en la semivida sérica durante el estudio preclínico de farmacocinética.
El impacto es directo y relevante para la eficacia clínica, los resultados en los pacientes y las vías de aprobación regulatoria, estableciendo una base para controlar el pH como un parámetro crítico del proceso (CPP) según las directrices ICH Q5 y Q8.
Preguntas frecuentes
¿Cuál es la importancia de mantener los niveles de pH en los biorreactores de cultivo celular?
Para que el cultivo celular de mamíferos alcance una productividad óptima, el pH debe mantenerse entre 7,2 y 7,4. Este rango de pH garantiza la absorción celular de nutrientes, la estabilidad de la membrana y las reacciones enzimáticas adecuadas.
¿Cómo afecta el pH del biorreactor a la producción global en cuanto a calidad?
La producción del biológico deseado se verá negativamente afectada por cualquier cambio en el pH, lo que provocará variabilidad en la glucosilación, la viabilidad celular y las vías metabólicas. Esta variabilidad afectará, en última instancia, negativamente la productividad, la calidad y los resultados generales del proceso.
¿Qué métodos se utilizan para controlar el pH en los biorreactores?
los métodos de control del pH incluyen la inyección de CO₂, la dosificación automática de ácido/base y una combinación de un diseño mejorado del impulsor y una colocación optimizada de los sensores para mejorar las condiciones y reducir los fallos por lote.