L'intervallo fisiologico ottimale di pH per la crescita cellulare nei bioreattori per colture cellulari
Perché gli intervalli di pH compresi tra 7,2 e 7,4 proteggono l'integrità della membrana e ottimizzano l'assorbimento e le cinetiche
La produttività delle cellule di mammifero in un bioreattore per colture cellulari dipende dal mantenimento del pH extracellulare entro un ristretto intervallo compreso tra 7,2 e 7,4. Questo intervallo rappresenta un equilibrio di pH per tre pilastri biologici:
a. Cinetica enzimatica: gli enzimi metabolici sono influenzati dalla distribuzione delle cariche nelle zone sensibili al pH. L’attività enzimatica può ridursi fino al 40–60% a causa di cambiamenti conformazionali strutturali legati alle variazioni di pH.
b. Integrità della membrana: L'integrità della membrana è mantenuta entro un intervallo ristretto grazie ai gradienti elettrochimici e all'equilibrio osmotico del sistema di trasporto transmembranoso. Deviazioni da tale intervallo inducono rotture delle membrane.
c. Trasporto di nutrienti: Il trasporto di aminoacidi nelle cellule, in particolare degli aminoacidi essenziali a catena ramificata, è ridotto al punto tale che i principali precursori biosintetici vengono esauriti e la crescita cellulare risulta compromessa.
Le linee cellulari CHO e HEK293 sono particolarmente sensibili: anche una minima variazione di pH di 0,3 unità provoca una riprogrammazione irreversibile dei percorsi metabolici cellulari, come confermato dall’analisi del profilo trascrizionale e dall’analisi del bilancio dei flussi (Nature Biotechnology, 2021).
Impatto sulla vitalità, intervallo di pH e ruolo del pH nei bioreattori
Crescita negativa e perdita di vitalità in tutti i coltivi di HEK293 e CHO in presenza di una deviazione costante del pH
Lo squilibrio prolungato del pH osservato nelle linee standard dell’industria dei bioreattori per colture CHO determina:
- 40% di perdita di vitalità dovuta alla frammentazione del DNA p53 indotta dall’acido e all’upregulation di p53
- Aumento del 200% della produzione di acido dovuto al lattato, che rafforza l’acidificazione mediante un meccanismo di retroazione potenziato
- Riduzione della fase G1, che ha determinato una diminuzione del 50% del titolo prodotto a causa di un arresto trascrizionale delle proteine ricostruite
Tutti i sistemi HEK293 affrontano sfide simili: l’accuratezza della glicosilazione diminuisce drasticamente a pH 7,8. Si osserva un aumento di tre volte nel ripiegamento errato della galattosiltransferasi, il che compromette negativamente la funzione effettore degli anticorpi monoclonali (mAb). Queste variabilità comportano costi medi di 740.000 USD per ogni corsa del bioreattore (Ponemon Institute, Biomanufacturing Risk Report, 2023), evidenziando la necessità di un controllo preciso del pH nella bio-produzione su scala industriale e in conformità alle normative
fonti delle instabilità metaboliche
L’accumulo di CO₂ e il sistema tampone dei bioreattori con spargimento
Durante il processo di respirazione cellulare, viene prodotto CO₂ che reagisce con H₂O, formando acido carbonico (H₂CO₃), il quale si dissocia parzialmente in H⁺ e HCO₃⁻. Nel corpo è presente un meccanismo tampone intrinseco a base di bicarbonato (CO₂ + H₂O ↔ H₂CO₃ ↔ H⁺ + HCO₃⁻) che mantiene l’equilibrio, ma questo può collassare rapidamente, in particolare in presenza di un metabolismo significativamente elevato. Si consideri, ad esempio, i bioreattori con spargimento di gas. In questi sistemi, un flusso di gas nel bioreattore non adeguatamente controllato può generare concentrazioni locali di CO₂ superiori a 120 mM. Ciò determina una diminuzione significativa del pH di mezzo a un’unità. Queste piccole zone di accumulo causano problemi quali il malfunzionamento della lattato deidrogenasi e lo squilibrio dello scambiatore Na⁺/H⁺, accelerando notevolmente il processo di acidosi in aree localizzate della coltura.
Acidificazione indotta dal lattato: un ciclo di retroazione nelle colture cellulari ad alta densità nei bioreattori
Quando la densità di cellule vitali supera 10⁶ cellule/mL, si osserva un aumento esponenziale del consumo di glucosio e una prevalenza della glicolisi, anche in presenza di ossigeno (l’«effetto Warburg»). Ciò innescà un aumento della produzione di lattato e di ioni H⁺, avviando un ciclo autoalimentato:
L’aumento della concentrazione di ioni H⁺ nella soluzione (riduzione del pH) attiva le pompe di estrusione protonica (ad es. NHE1), che dirottano l’ATP lontano dai processi biosintetici.
Questo stress energetico stimola ulteriormente la glicolisi, portando a una maggiore produzione di ioni H⁺ e lattato.
Nelle colture di cellule CHO, il lattato viene prodotto in eccesso rispetto a 20 mM entro poche ore, causando un abbassamento del pH della soluzione globale al di sotto di 6,8 e una riduzione della produttività specifica del 35%. Ciò sposta inoltre il metabolismo della coltura lontano da mTORC1, determinando una diminuzione della traduzione, del ripiegamento proteico e della capacità biosintetica complessiva.
Sviluppo di metodi di controllo del pH per il funzionamento su larga scala dei bioreattori per colture cellulari
Sparging con CO₂ rispetto alla dosatura automatica di acido/base
La spurgatura con CO₂ ha effettivamente il vantaggio di abbassare rapidamente il pH, ma presenta anche alcuni svantaggi. La generazione di schiuma, l’aumento dello stress da taglio all’interno del sistema e una transitoria variazione del sistema tampone del bicarbonato possono influenzare negativamente alcuni trasportatori sensibili al pH. Principalmente, a causa del controllo rapido del pH, si preferiscono sistemi automatizzati di dosaggio di acido o base. Questi sistemi sono in grado di riportare il pH alle condizioni normali entro circa 30 secondi, un intervallo di tempo significativo per alcune linee cellulari, come ad esempio HEK293. Va osservato che una progettazione scadente del metodo di erogazione del titolante può causare lo sviluppo di condizioni localmente acide, che possono compromettere la vitalità cellulare. La maggior parte dei laboratori utilizza una combinazione di tecniche, in particolare per bilanciare il consumo di ossigeno. Il CO₂ è efficace per effettuare queste regolazioni grossolane, mentre la titolazione automatica è impiegata per il controllo fine.
In che modo la progettazione dell’agitatore e la posizione del sensore influenzano i gradienti spaziali di pH
Gradienti di 0,3 unità pH sono relativamente comuni intorno alle pale delle turbine durante un miscelamento incompleto e sono particolarmente evidenti con turbine radiali di tipo Rushton. I modelli di dinamica dei fluidi computazionale dimostrano che una turbina a pale inclinate è più efficace nel favorire la distribuzione del flusso lungo l'asse e nella riduzione dei gradienti del 40%. Inoltre, essa elimina le zone stagnanti in cui il lattato tende a diffondersi durante lunghi periodi di stazionamento. La posizione dei sensori di pH è altrettanto critica. Posizionare i sensori sulla parete, nelle vicinanze dei portelli di raccolta, e al centro del recipiente risulta più efficace per la raccolta di dati sul pH durante il monitoraggio operativo, rispetto al posizionamento dei sensori nella parte superiore del recipiente o in prossimità delle pale delle turbine. La combinazione di un posizionamento intelligente dei sensori e della regolazione in tempo reale dell’agitazione di miscelazione si rivela efficace nel contenere l’acidosi in tutto il sistema. La pubblicazione del 2022 di BioPharm International afferma che questo approccio è efficace nella riduzione del tasso di fallimento dei lotti del 22%.
Esistono effetti a valle derivanti dalla mancata gestione di livelli ottimali di pH nei processi di coltura cellulare in bioreattori.
Effetto sulla titolazione del prodotto, sul grado di apoptosi e sulla regolarità del processo.
I bioreattori iniziano a mostrare guasti gravi quando i livelli di pH si discostano dall'intervallo ottimale compreso tra 7,2 e 7,4. Ad esempio, se il livello di pH non viene modificato e rimane inferiore a 6,8 per oltre 12 ore, i rendimenti dei prodotti diminuiscono di circa il 30%. Come conseguenza di tale fenomeno, le cellule non sono in grado di assorbire quantità sufficienti di glutammina, causando un arresto ribosomiale durante la traduzione. Al contrario, un'eccessiva acidità non è più desiderabile, poiché costituisce un fattore principale di morte cellulare e, in particolare, determina un aumento di circa il 20% dell'apoptosi delle cellule CHO a causa del fenomeno della fuoriuscita di citocromo c mitocondriale. Inoltre, quando il pH di un bioreattore supera 7,6, si verificano numerosi effetti indesiderati, quali l’attivazione della risposta da stress del reticolo endoplasmatico (ER) e l’attivazione della via della risposta alle proteine non ripiegate (UPR), una delle peggiori tipologie di risposta ER. In sintesi, condizioni di pH fuori dai limiti previsti nei bioreattori comportano un aumento della variabilità del processo. Si possono prevedere registrazioni di lotti con una variabilità di circa il 15% nei rendimenti finali a partire da registrazioni di pH che presentino una deviazione superiore a 0,2 unità rispetto al valore obiettivo. Secondo le linee guida ICH Q5A(R2), tale variabilità e inconsistenza solleva allerte presso gli uffici regolatori durante le validazioni FDA, dato che la coerenza qualitativa riveste un’importanza fondamentale nel settore farmaceutico.
Impatti delle variazioni del pH sugli attributi di qualità degli anticorpi monoclonali e sui cambiamenti nel profilo della glicosilazione
Le variazioni del pH provocano modifiche alle modificazioni post-traduzionali delle proteine. Se il pH dell’ambiente è inferiore a 7,0, l’attività della galattosiltransferasi diminuisce del 40%, poiché l’attività dei residui istidinici protonati favorisce una maggiore glicosilazione di tipo high-mannose (18%) negli anticorpi monoclonali, con conseguente ridotta capacità di legame ai recettori Fc gamma RIIIa e, di conseguenza, una diminuzione della citotossicità cellulare mediata dagli anticorpi. Lo scenario opposto si verifica a valori di pH superiori a 7,5: si osserva un errato indirizzamento della sialiltransferasi, che determina una degradazione precoce dell’acido sialico. L’effetto complessivo è una sialilazione insufficiente dei prodotti e una più rapida eliminazione dei prodotti dalla circolazione dopo la somministrazione. Tutte queste variazioni qualitative influenzano gli attributi di qualità fondamentali, che i produttori devono monitorare attentamente.
riduzione del 25% dell’affinità per FcΓRIIIa
aumento triplo nella formazione di particelle subvisibili e nell’aggregazione.
Fino al 40% di riduzione della emivita sierica durante lo studio preclinico di farmacocinetica.
L’impatto è diretto e rilevante per l’efficacia clinica, l’esito per il paziente e le vie di approvazione regolatoria, stabilendo una base per il controllo del pH come Parametro Critico di Processo (CPP) ai sensi delle linee guida ICH Q5 e Q8.
Domande frequenti
Qual è l’importanza del mantenimento dei livelli di pH nei bioreattori per colture cellulari?
Per ottenere la massima produttività nelle colture cellulari di mammifero, il pH deve essere mantenuto tra 7,2 e 7,4. Questo intervallo di pH garantisce l’assorbimento cellulare dei nutrienti, la stabilità della membrana e il corretto svolgimento delle reazioni enzimatiche.
In che modo il pH del bioreattore influisce sulla produzione complessiva e sulla qualità?
La produzione del biologico desiderato sarà negativamente influenzata da una variazione del pH, causando variabilità nella glicosilazione, nella vitalità cellulare e nei percorsi metabolici. Tale variabilità avrà infine un impatto negativo sulla produttività, sulla qualità e sui risultati complessivi del processo.
Quali metodi vengono utilizzati per controllare il pH nei bioreattori?
i metodi di controllo del pH includono la spurgatura con CO₂, l’erogazione automatica di acido/base e una combinazione di progettazione migliorata dell’agitatore e posizionamento ottimizzato dei sensori per migliorare le condizioni e ridurre i fallimenti dei lotti.