הטווח הפיזיולוגי האופטימלי של pH לגידול תאים בביוריאקטורים לתרבויות תאים
למה טווחי ה-pH 7.2–7.4 מגינים על שלמות המembrנה ומממשים את הספיגה והקינטיקה באופטימום
תפוקת תאים מammalian בביוריאקטור לתרבויות תאים תלויה במגבלה של ה-pH החוץ-תאי לטווח צר של 7.2–7.4. טווח זה מאוזן pH בשלושה עמודי תורן ביולוגיים:
א. קינטיקת אנזימים: אנזימי חילוף החומרים מושפעים מהפיזור המטען בטווחי pH רגישים. פעילות האנזים יכולה להקטן עד 40–60% עקב שינויים בתצורה המבנית שלה לאורך טווחי ה-pH.
ב. שלמות הממברנה: שלמות הממברנה מושמרת בתוך טווח צר הודות למדדי הפוטנציאל החשמלי-כימי ולאיזון האוסמוטי של מערכת העברת הממברנה. סטיות מטווח זה גורמות לקפיצות בממברנות.
ג. העברת חומרים מזינים: העברת חומצות אמינו לתוך התאים, ובמיוחד חומצות אמינו impresיות מסועעיות, מצטמצמת במידה כה גדולה עד שמקורם הביו-סינטטי העיקרי נגמר וצמיחת התאים עוצרת.
קווי התאים CHO ו-HEK293 רגישים במיוחד, וסטיה קלה ביותר ב-pH בגודל 0.3 יחידות גורמת לתוכנית מחדש בלתי הפיכה של נתיבי המטבוליזם התאי, כפי שנאשף על ידי פרופיל טרנסקריפציה וניתוח איזון זרימה (Nature Biotech, 2021).
השפעת היכולת לשרוד, טווח ה-pH והתפקיד שלו במיקרוביאורקטורים
צמיחה שלילית ואיבוד יכולת לשרוד בכל התרבויות של HEK 293 ו-CHO תחת סטיית pH קבועה
אי-איזון pH מתמשך בתרבויות CHO, כפי שמופיע בקווי הייצור הסטנדרטיים למיקרוביאורקטורים, גורם ל:
- ירידה של 40% ביכולת הישרדות התאים עקב שבירת ה-DNA של p53 ועליית רמות p53 המושרית על ידי חומציות
- עלייה של 200% בייצור החומצה עקב לקטט, מה שמגביר את החומציות באמצעות משוב חיובי
- ירידה בפאזה G1, אשר גרמה לירידה של 50% בתכולת המוצר (Product Titer) כתוצאה מהפסק תרגום של חלבונים מאוחדים מחדש.
כל מערכות HEK293 ניצבות בפני קשיים דומים: דיוק הגליקוזילציה יורד באופן דרמטי ב-pH של 7.8. יש עלייה של פי 3 בשכיחות הקיפול הלא תקין של גלקטוזילטרנספרז, מה שמשפיע לרעה על פעילות המוצא (effector function) של נוגדנים חד-קלוניים (mAbs). השונות הזו עולה בממוצע 740,000 דולר לכל הפעלת ביוריאקטור (דוח סיכון ביוייצור של מכון פונמון, 2023), מה שמצביע על החשיבות הקריטית של בקרת ה-pH בייצור ביוטכנולוגי ברמות שניתן להרחיב ולעמוד בהן בדרישות התקנות.
מקורות הבלתי יציבות מטבוליות
הצטברות של CO₂ ומערכת הספיגה (Buffering System) בביו-ריאקטורים עם אספקת אוויר (Sparged Bioreactors)
במהלך תהליך הנשימה התאית, נוצר CO₂ שמתערבב עם H₂O ויוצר חומצה פחמנית (H₂CO₃), אשר מתפצלת חלקית ל־H⁺ ול־HCO₃⁻. בגוף קיימת מנגנון ספיגה בי-קרבונטי מובנה (CO₂ + H₂O ↔ H₂CO₃ ↔ H⁺ + HCO₃⁻) שמתחזק את האיזון, אך הוא יקרוס במהרה במיוחד במטבוליזם גבוה באופן משמעותי. לדוגמה, ניתן להתייחס לביוריאקטורים המניעים אדים (sparged bioreactors). במערכות אלו, כמות גדולה מדי של CO₂ הנגרמת על ידי זרימת הגז הלא מתאימה מהביוריאקטור יכולה ליצור ריכוזים קטנים של CO₂ מעל 120 מילימולר. מצב זה יוביל לירידת pH משמעותית של חצי עד יחידה אחת. הכיסונים הקטנים הללו יוצרים בעיות כגון תפקוד לקוי של הלקטט דהידרוגנאז (lactate dehydrogenase) והפרעה לאיזון של המחלף Na⁺/H⁺, מה שמאיץ במידה רבה את תהליך החמצת (acidosis) באזורים מקומיים של התרביה.
חמצת נגרמת על ידי לקטט: לולאת משוב בתהליכי ביוריאקטור של תרבויות תאיות בצפיפות גבוהה
כשצפיפות התאים החיוניים עולה על 10⁶ תאים למיליליטר, צורכת הגלוקוז עולה באופן אקספוננציאלי ומנגנון הגליקוליזה נעשה דומיננטי, גם בנוכחות חמצן ("אפקט וארבורג"). תופעה זו מובילה לעליה ביצירת לקטט ובעלת יונים חיוביים (H⁺), אשר פועלת כמעגל עצמאי-מונע:
עלייה בריכוז ה-H⁺ בתמיסה (ירידה ב-pH) מפעילה משאבות להדחת פרוטונים (למשל, NHE1), מה שמביא להסטת ATP מתהליכים ביוסינתטיים.
מתח האנרגיה הזה מעורר עוד יותר את הגليكוליזה, מה שמוביל ליצירת עוד H⁺ ולקטט.
בתאי CHO, הלקטט נוצר בכמויות העולות על 20 מילימולר תוך שעות ספורות, מה שגורם לירידת ה-pH של התמיסה הכוללת מתחת ל-6.8 ולחיסול היצרנות הספציפית ב-35%. בנוסף, תהליך זה משנה את המטבוליזם של התרביתיות מהמסלול mTORC1, מה שמביא לצניחה בתרגום, בקיפול חלבונים וביכולת הביוסינתטית הכוללת.
פיתוח שיטות בקרת pH להפעלה בקנה מידה גדול של ביוריאקטורים לתרבות תאים
חיבוש CO₂ לעומת דיזוז אוטומטי של חומצה/בסיס
לזריקת CO₂ יש את היתרונות של הורדת מהירה של ה-pH, אך קיימים גם כמה חסרונות. יצירת צמיגות, עלייה בלחץ הגזירה בתוך המערכת והיסט זמני במערכת הספוגית של הביקרבונט עלולים לפגוע במערכת של מובילים רגישים ל-pH. בעיקר בשל הבקרה המהירה על ה-pH, מערכות דיזוג אוטומטי של חומצה או בסיס מועדפות. מערכות אלו מסוגלות להחזיר את ה-pH לתנאים נורמליים תוך כ-30 שניות, פרק זמן משמעותי עבור קווי תאים מסוימים כמו HEK293. יש לציין כי תכנון לקוי בשיטת ההזרקה של החומר המטיטר עלול לגרום להתפתחות תנאים חומציים מקומיים שעלולים לפגוע בקיימות התאים. רוב המעבדות משתמשות בשילוב של טכניקות, במיוחד לאיזון צריכת החמצן. CO₂ יעיל לביצוע התאמות גסות אלו, ואילו הדיזוג האוטומטי משמש לבקרה עדינה.
איך עיצוב הטחנת המערבולת ומיקום החיישנים משפיעים על הגרדיאנטים המרחביים של ה-pH
גרדיאנטים של 0.3 יחידות pH הם נפוצים יחסית באזור הלחיצנים במהלך ערבוב לא מלא, ובעיקר בולטים בטורבינות רושטון זורמות רדיאלית. מודלים של דינמיקת נוזלים חישובית מראים שלחיצן עם להבים משופעים יעיל יותר בהשגת התפלגות זרימה לאורך הציר והפחתת הגרדיאנטים ב-40%. הוא גם מאפס את האזורים הסטטיים שבהם הלקטט חודר במהלך תקופות עצירה ממושכות. מיקום חיישני ה-pH חשוב באותה מידה. מיקום החיישנים על הקיר קרוב ליציאות האגירה ובמרכז המיכל יעיל יותר לאיסוף נתוני pH בזמן ניטור פעילותי, לעומת מיקום החיישנים בראש המיכל או בקרבה רבה ללחיצנים. שילוב של מיקום אינטליגנטי של חיישנים והתאמות בזמן אמת של ערבוב מזדעזע יעיל במניעת אסידוזיס בכל המערכת. פרסום של BioPharm International משנת 2022 קובע שהגישה יעילת הפחתת כשל אצווה ב-22%.
ישנם תופעות לוואי צורניות של אי-ניהול רמות pH אופטימליות בתהליכי ביוריאקטורים של תרבית תאים.
השפעה על ריכוז התוצר, על דרגת האפופטוזיס ועל סדירות התהליך.
ריאקטורים ביולוגיים מתחילים להפגין תקלות חמורות כאשר רמות ה-pH סוטות מהטווח האופטימלי של 7.2–7.4. לדוגמה, אם רמת ה-pH אינה מתוקנת ונותרת נמוכה מ-6.8 במשך יותר מ-12 שעות, היבואים של המוצרים יקטנו בקרוב ל-30%. כתוצאה מתופעה כזו, התאים אינם מסוגלים לספיגת כמויות מספיקות של גלוטמין, מה שגורם לעיכוב בריבוזומים במהלך תהליך התרגום. מצד שני, חומציות יתרה איננה רצויה אף היא, מאחר שהיא תורמת משמעותית למוות התאים, ובפרט היא מביאה לעליה של כ-20% באפופטוזיס של תאי CHO בעקבות תופעת דליפת הסיטוכروم c המיטוכונדריאלית. בנוסף, כאשר רמת ה-pH בריאקטור הביולוגי עולה על 7.6, מתרחשות רבות תופעות לא רצויות, כגון הפעלת תגובת הלחץ של הרשת האנדופלזמית (ER) והפעלת נתיב תגובת החלבונים הלא מקופלים (UPR), אשר אחת מתגובות ה-ER הקשות ביותר. לסיכום, תנאים של pH מחוץ לתחום המותר בריאקטור הביולוגי גורמים להגברת השונות בתהליך. ניתן לצפות בשיעור שונות של כ-15% בהיבואים הסופיים ברכות ייצור שרשומות ה-pH שלהן סוטות מהערך המטרה ביותר מ-0.2 יחידות. לפי הנחיות ICH Q5A(R2), שונות ואי-עקביות מסוג זה מעוררות את תשומת הלב של המחלקה ליחסים רגולטוריים בעת אישורים של ה-FDA, מאחר שיציבות באיכות היא קריטית במיוחד בתעשייה הפקולטית.
השפעות של שינויים ברמות ה-pH על תכונות האיכות של נוגדנים מונוקלונליים והשתנות בדפוס הגליקוזילציה
שינויים ברמות ה-pH גורמים לשינויים בתהליכים שלאחר תרגום של חלבונים. אם רמת ה-pH של הסביבה נמוכה מ-7.0, פעילות הגלקטוזילטרנספרז תקטן ב-40%, מאחר שפעילות שאריות היסטידין פרוטוניות מביאה להגברה של גליקוזילציה מסוג high-mannose (18%) בנוגדנים מונוקלונליים, מה שמוביל לירידה בקשר לקולטני Fc gamma RIIIa, ובהתוצאה לכך לירידה בציטוטוקסיות תלוית תאי דם אנטיגנית. המקרה ההפוך מתרחש ברמות pH גבוהות מ-7.5. קיים אי-توجيه של הסיאליטרנספרז, אשר גורם לפירוק מוקדם של חומצת הסיאלית. התוצאה הכוללת היא חוסר סיאليلציה במוצרים ותהליך זרימה מהיר יותר של המוצרים מחוות הדם לאחר מתן הטיפול. כל השינויים באיכות משפיעים על תכונות האיכות העיקריות שעל יצרני התרופות לפקח עליהן באופן הדוק.
הפחתה של 25% באפיניות לקולטן FcΓRIIIa
הכפלה שלוש פעמים ביצירת חלקיקים תת-ראייתיים ובהיווצרות אגטגרציה.
הפחתה של עד 40% באורך מחצית החיים של הסרום במהלך הבדיקה פרה-קלינית של פארמקוקינטיקה.
ההשפעה היא ישירה ורלוונטית ליעילות קלינית, לתוצאות המטופל ולמסלולי האישור التنظימי, ומייצרת בסיס לבקרה על ערך ה-pH כפרמטר תהליך קריטי (CPP) בהתאם להנחיות ICH Q5 ו-Q8.
שאלות נפוצות
מהו החשיבות של שימור רמות ה-pH במקררים ביולוגיים לתרבויות תאים?
כדי להשיג יעילות מירבית בתרבויות תאים של יונקים, יש לשמור על ערך ה-pH בין 7.2 ל-7.4. טווח זה מבטיח ספיגה תאית של חומרי מזון, יציבות של הממברנה התאית והתפתחות תקינה של תגובות אנזימטיות.
איך משפיע ערך ה-pH במקרר הביולוגי על איכות הייצור בכלל?
ייצור הביופרמצביל הרצוי ייפגע לרעה כתוצאה משינוי בערך ה-pH, מה שיגרום לשונות בגליקוזילציה, בשיעור הישרדות התאים ובנתיבי המטבוליזם. השונות הזו תפגע בסופו של דבר בייצוריות, באיכות ובתוצאות הכוללות של התהליך.
אילו שיטות משמשות לשליטה ב-pH בביוריאקטורים?
שיטות שליטה ב-pH כוללות דליפת CO₂, הזרקה אוטומטית של חומצה/בסיס, ושילוב של עיצוב משופר של המניע והצבת חיישנים מואמזת כדי לשפר את התנאים ולפחית את כשלים באצווה.