Основные физиологические различия между микроорганизмами, продуцирующими ферменты и антибиотики
Чувствительность актиномицетов и бацилл к кислороду и pH
Актиномицеты, продуцирующие антибиотики (например, Streptomyces), и штаммы Bacillus, вырабатывающие ферменты, демонстрируют заметные различия в устойчивости к условиям окружающей среды. Для оптимального синтеза антибиотиков, таких как стрептомицин, актиномицетам необходим уровень растворённого кислорода (DO) выше 30 % и нейтральный pH (7,0–7,5). Актиномицеты обладают нитевидной морфологией, что приводит к плохой диффузии кислорода в нитях. Напротив, штаммы Bacillus обычно функционируют при уровнях DO в диапазоне 20–30 % и щелочных сдвигах pH (6,5–8,0) в процессе производства протеаз. Штаммы Bacillus имеют палочковидную морфологию, что обеспечивает высокую эффективность поглощения кислорода. Эти физиологические ограничения предоставляют важную информацию проектировщикам микробных ферментёров при разработке систем аэрации и pH-статических регуляторов.
Тип микроорганизма Требование к кислороду Оптимальный диапазон pH Продукт
Актиномицеты насыщение DO > 30 % 7,0–7,5 Пенициллин, стрептомицин
Bacillus насыщение DO 20–30 % 6,5–8,0 Протеазы, амилазы
Динамика образования продуктов, связанная и несвязанная с ростом
Производство ферментов (рекомбинантных протеаз) тесно связано с ростом и достигает максимума в экспоненциальной фазе, когда наблюдается интенсивное поглощение питательных веществ и, как следствие, более высокая метаболическая активность. Большинство (более 70 %) доступных в промышленности ферментов получают из штаммов рода Bacillus в экспоненциальной фазе роста. Производство антибиотиков, напротив, осуществляется в стационарной фазе цикла. Стационарная фаза характеризуется вторичным метаболизмом, не связанным с ростом. В этой фазе филаментозные бактерии (например, актиномицеты)
Конструктивные особенности микробных ферментёров для максимизации выхода антибиотиков
Конструирование ферментёров для производства бензилпенициллина G и стрептомицина
Для синтеза антибиотиков экологический процесс ферментации актиномицетов должен быть чрезвычайно строгим. При получении пенициллина методом G растворённый кислород должен составлять более 30 % от насыщения, тогда как при производстве стрептомицина концентрация растворённого кислорода должна поддерживаться ниже 20 %, что может привести к снижению выхода продукта на 40–60 % (BioProcessing Journal, 2023). Процесс метаболизма пенициллина прекращается при pH от 6,5 до 7,0. При pH выше 7,8–8,2 также прекращается процесс синтеза стрептомицина. Современные ферментёры решают задачу поддержания оптимального уровня кислорода за счёт совместного применения турбинных мешалок и систем продувки газом. В ферментёрах используются интегрированные автоматизированные датчики, способные самостоятельно корректировать pH путём добавления CO₂ или щелочи для предотвращения резкого падения pH, вызванного накоплением органических кислот.
Расширение вторичного метаболизма за счёт перехода от периодического режима к другому режиму
Образование антибиотиков происходит на заключительной стадии вторичного метаболизма в стационарной фазе. Синтез пенициллина G осуществляется при поддержании концентрации глюкозы ниже 0,5 г/л, чтобы предотвратить прерывание синтеза в биосинтетических путях. Фаза продукции удлиняется более чем на 40–60 часов, а выход повышается до 50 % по сравнению с традиционной периодической культурой. В процессе ферментации накапливаются побочные продукты, которые могут оказать негативное влияние на ход процесса. Основное внимание уделяется синтезу антибиотиков, а клеточная энергия направляется именно на этот синтез.
Рекомендации по конфигурации микробных ферментеров для производства терапевтических ферментов
Конструкция мешалки с низким сдвиговым воздействием и стратегии регулирования pH-стат для обеспечения стабильности рекомбинантных протеаз
При производстве терапевтических ферментов, таких как рекомбинантные протеазы, требуются специализированные конфигурации ферментёров для предотвращения структурной деградации. Импеллеры с низким сдвиговым воздействием, например лопастные импеллеры с наклоном лопастей и гидрокрыльчатые импеллеры, эффективно обеспечивают сохранность белковой структуры и предотвращают снижение активности протеаз. Система контроля pH по принципу pH-stat, поддерживающая диапазон pH на уровне 6,5–7,5 для протеаз за счёт автоматической коррекции количества добавляемых кислоты и щёлочи, является необходимым дополнением к системе. При неудовлетворительном контроле pH происходят конформационные изменения, обусловленные колебаниями pH, что резко подавляет активность протеаз — в отдельных случаях даже на 50 % за один цикл. При совместном использовании эти две системы значительно повышают выход продукта и гарантируют его соответствие установленным в отрасли нормативным требованиям.
Выбор подходящего типа микробного ферментёра с учётом масштаба производства, правовой базы и желаемого результата
Выбор подходящего микробного ферментера представляет собой согласование трёх переменных: масштаба производства, правовых ограничений и характеристик требуемого конечного продукта. На самых низких уровнях производства для исследовательских и пилотных проектов используются небольшие модульные системы, а на самых высоких уровнях — исследования промышленного производства антибиотиков осуществляются в крупных перемешиваемых реакторах с автоматической стерилизацией, что позволяет удовлетворить многочисленные требования современной фармацевтики. На самых высоких уровнях выхода продукции производство высокоэффективных терапевтических ферментов и массово производимых метаболитов осуществляется с применением, соответственно, импеллеров с низким сдвиговым воздействием и турбин Раштона с высокой скоростью переноса кислорода. Данные свидетельствуют, что в 34 % случаев неудачной передачи технологий от исследовательских проектов к производству причиной является несоответствие масштаба и технологии, что приводит к провалу ферментационных проектов. Можно с уверенностью утверждать, что успешная реализация в значительной степени зависит от соответствия требованиям, выхода продукта и эксплуатационной эффективности, заложенных в систему на ранних этапах её проектирования.
Часто задаваемые вопросы
Какие экологические факторы влияют на производство антибиотиков и ферментов?
Для биосинтеза антибиотиков актиномицеты нуждаются в достаточном содержании растворённого кислорода (>30 % насыщения) и нейтральном значении pH в диапазоне 7,0–7,5. Штаммы Bacillus, продуцирующие ферменты, предпочитают умеренные уровни растворённого кислорода (20–30 %) и щелочное значение pH в диапазоне 6,5–8,0.
В чём разница между рост-ассоциированным и нерост-ассоциированным производством?
Рост-ассоциированное производство — это синтез микробных ферментов, происходящий в экспоненциальной фазе роста, тогда как производство антибиотиков, происходящее в стационарной фазе, является примером нерост-ассоциированного производства.
Какие конфигурации ферментёров обеспечивают высокий выход антибиотиков?
Перемешиваемые ферментёры с турбинными мешалками (в сочетании с точным контролем DO/pH) являются оптимальным выбором для производства таких антибиотиков, как пенициллин и стрептомицин. Наибольшее повышение выхода обеспечивается стратегиями периодического пополнения питательной среды (fed-batch), продлевающими стационарную фазу производства.
Как спроектирован ферментер для производства терапевтических ферментов?
При производстве терапевтических ферментов используются импеллеры с низким сдвиговым усилием, чтобы избежать денатурации белков. Кроме того, для поддержания стабильности фермента в диапазоне pH от 6,5 до 7,5 применяется передовая система управления pH (pH-stat).
Почему выбор ферментера для микробиологического процесса имеет важное значение?
Выбор ферментера тесно связан с масштабом производства, логическим учётом выхода продукта процесса, а также производством этапов, выведенных на рынок, с учётом регуляторных ограничений.