Główne różnice fizjologiczne między mikroorganizmami produkującymi enzymy a tymi produkującymi antybiotyki
Wrażliwość na tlen i pH wśród actinomycetes i Bacillus
Antybiotyki produkujące aktinomycety (np. Streptomyces) oraz szczepleń enzymotwórczych Bacillus wykazują istotne różnice w odporności na warunki środowiskowe. Aktinomycety wymagają stężenia rozpuszczonego tlenu (DO) powyżej 30% oraz odczynu bliskiego obojętnemu (pH 7,0–7,5), aby zapewnić optymalną syntezę antybiotyków takich jak streptomycyna. Aktinomycety mają morfologię grzybopodobną (włóknistą), co powoduje słabe dyfundowanie tlenu do wnętrza włókien. Natomiast szczepleń Bacillus zwykle funkcjonują przy stężeniu DO w zakresie 20–30% oraz przy przesunięciach odczynu w kierunku zasadowym (pH 6,5–8,0) podczas produkcji proteaz. Szczepy Bacillus mają morfologię pałeczkowatą, co zapewnia wysoką skuteczność pobierania tlenu. Te ograniczenia fizjologiczne dostarczają projektantom fermentorów mikrobiologicznych ważnych informacji dotyczących konstrukcji systemu napowietrzania oraz regulatorów pH.
Typ mikroorganizmu Wymaganie tlenu Optymalny zakres pH Produkt
Aktinomycety > 30% nasycenia DO 7,0–7,5 Penicylina, streptomycyna
Bacillus 20–30% nasycenia DO 6,5–8,0 Proteazy, amylazy
Dynamika powstawania produktów związana i niezwiązana z wzrostem
Produkcja enzymów (proteaz rekombinowanych) jest silnie związana z wzrostem i osiąga szczyt w fazie wykładniczej, kiedy zachodzi intensywne pobieranie składników odżywczych oraz, jako skutek tego, zwiększone wyjście metaboliczne. Większość (ponad 70%) łatwo dostępnych enzymów przemysłowych pochodzi od szczepów Bacillus w fazie wykładniczej wzrostu. Produkcja antybiotyków odbywa się natomiast w fazie stacjonarnej cyklu. Faza stacjonarna charakteryzuje się metabolizmem wtórnym niezwiązanym z wzrostem. W tej fazie grzyby niciowe (np. actinomycety)
Cechy konstrukcyjne fermentorów mikrobiologicznych zapewniające maksymalną produkcję antybiotyków
Konstrukcja fermentorów do produkcji penicyliny G i streptomycyny
Aby syntetyzować antybiotyki, środowiskowy proces fermentacji aktynomycetów musi być bardzo wymagający. W przypadku syntezy penicyliny (G) stężenie tlenu rozpuszczonego musi przekraczać 30% nasycenia, podczas gdy w przypadku streptomycyny stężenie tlenu rozpuszczonego musi być kontrolowane na poziomie poniżej 20%, co może spowodować obniżenie wydajności o 40–60% („BioProcessing Journal”, 2023). Proces metabolizmu penicyliny ustaje przy pH od 6,5 do 7,0. Powyżej pH 7,8–8,2 przerywa się również proces metabolizmu streptomycyny. Nowoczesne fermentory radzą sobie z wyzwaniem utrzymania odpowiednich poziomów tlenu poprzez jednoczesne zastosowanie wirników turbinowych i systemów wprowadzania gazu (sparging). Fermentory są wyposażone w zintegrowane, zautomatyzowane sondy, które mogą samoczynnie korygować pH poprzez dodawanie CO₂ lub zasady w celu zapobieżenia jego gwałtownemu spadkowi spowodowanemu gromadzeniem się kwasów organicznych.
Rozszerzenie metabolizmu wtórnego poprzez przejście z trybu partiiowego
Powstawanie antybiotyków zachodzi w końcowej fazie metabolizmu wtórnego, w fazie stacjonarnej. Synteza penicyliny i penicyliny G zachodzi, gdy stężenie glukozy jest utrzymywane na poziomie poniżej 0,5 g/L, aby zapobiec zakłóceniu syntezy w ścieżkach biosyntetycznych. Faza produkcyjna jest wydłużana o ponad 40–60 godzin, a przychód wzrasta nawet o 50% w porównaniu do tradycyjnej metody partiiowej. W procesie fermentacji gromadzą się produkty uboczne, które mogą być szkodliwe dla przebiegu procesu. Głównym celem jest synteza antybiotyków, a energia komórkowa jest kierowana właśnie na tę syntezę.
Najlepsze praktyki konfiguracji fermentorów mikrobiologicznych w produkcji enzymów terapeutycznych
Projektowanie mieszadeł o niskim naprężeniu ścinającym oraz strategie oparte na regulacji pH (pH-stat) w celu zapewnienia stabilności rekombinowanego proteazy
Podczas produkcji enzymów terapeutycznych, takich jak rekombinowane proteazy, konieczne są specjalne konfiguracje fermentorów, aby uniknąć degradacji strukturalnej. Konstrukcje mieszadeł o niskim naprężeniu ścinającym, takie jak mieszadła z nachylonymi łopatkami lub typu hydrofoil, skutecznie zapobiegają denaturacji białek i pomagają uniknąć utraty aktywności proteaz. System regulacji pH w trybie pH-stat, który utrzymuje zakres pH na poziomie 6,5–7,5 dla proteaz poprzez automatyczną korekcję ilości dodawanych kwasu i zasady, stanowi niezbędne uzupełnienie systemu. Niewłaściwa kontrola pH powoduje zmiany konformacyjne zależne od pH oraz znacznie hamuje aktywność proteaz – potencjalnie nawet o 50 % w jednym cyklu. Po połączeniu oba te systemy znacznie zwiększają wydajność procesu i zapewniają zgodność produktu z obowiązującymi w branży przepisami.
Wybór odpowiedniego typu fermentora mikrobiologicznego w zależności od skali produkcji, ram prawnych oraz oczekiwanego rezultatu
Wybór odpowiedniego fermentora mikrobiologicznego wymaga wyrównania trzech zmiennych: skali produkcji, ograniczeń prawnych oraz cech wymaganego produktu końcowego. Na najniższym poziomie produkcji projekty badawcze i pilotażowe wykorzystują małe, modułowe systemy, natomiast na najwyższym poziomie badania nad przemysłową produkcją antybiotyków wykorzystują duże reaktory mieszane z automatyczną sterylizacją, aby spełnić liczne wymagania współczesnej farmacji. Na najwyższym poziomie mocy wyjściowej produkcja wysokowartościowych enzymów terapeutycznych kontrastuje się z użyciem mieszadeł o niskim ścinaniu, podczas gdy produkcja metabolitów możliwych do masowej syntezy – z turbinami Rushtona zapewniającymi wysoką przenikalność tlenu. Dane wskazują, że w 34% przypadków nieudanej transmisji technologii z projektów badawczych do produkcji przyczyną jest niewłaściwe dopasowanie skali do technologii, co prowadzi do niepowodzenia projektów fermentacyjnych. Można bezpiecznie stwierdzić, że powodzenie wdrożenia zależy w dużym stopniu od zgodności z wymaganiami, uzyskiwanej wydajności oraz efektywności eksploatacyjnej zaprojektowanych w systemie już na wczesnym etapie.
Często zadawane pytania
Jakie czynniki środowiskowe wpływają na produkcję antybiotyków i enzymów?
W przypadku biosyntezy antybiotyków aktinomycety zależą od wystarczającej ilości rozpuszczonego tlenu (>30% nasycenia) oraz obojętnej wartości pH w zakresie 7,0–7,5. Szczepy Bacillus produkujące enzymy woleją umiarkowane stężenie rozpuszczonego tlenu (20–30%) oraz odczyn zasadowy o wartości pH 6,5–8,0.
Jaka jest różnica między produkcją powiązaną z wzrostem a produkcją niepowiązaną z wzrostem?
Produkcja powiązana z wzrostem to produkcja enzymów mikrobiologicznych zachodząca w fazie wykładniczej, podczas gdy produkcja antybiotyków zachodząca w fazie stacjonarnej stanowi przykład produkcji niepowiązanej z wzrostem.
Jakie konfiguracje fermentorów zapewniają wysokowydajną produkcję antybiotyków?
Fermentory typu mieszalnikowego wyposażone w wirniki turbinowe (w połączeniu z dobrą kontrolą stężenia tlenu rozpuszczonego i pH) są najlepszym wyborem do produkcji takich antybiotyków jak penicylina i streptomycyna. Największy przyrost wydajności zapewniają strategie półciągłej (fed-batch) prowadzenia procesu, przedłużające fazę stacjonarną produkcji.
Jak zaprojektowano fermentor do produkcji enzymów terapeutycznych?
W produkcji enzymów terapeutycznych stosuje się mieszadła o niskim naprężeniu ścinającym, aby uniknąć denaturacji białek. Ponadto, w celu utrzymania stabilności enzymu w zakresie pH od 6,5 do 7,5, wykorzystuje się zaawansowany system regulacji pH (pH-stat).
Dlaczego wybór fermentora do procesu mikrobiologicznego jest ważny?
Wybór fermentorów wiąże się ściśle z skalą produkcji, logiczną oceną wydajności procesu oraz produkcją etapów przeznaczonych do wprowadzenia na rynek przy uwzględnieniu ograniczeń regulacyjnych.