Основни физиологични различия между микроорганизми, продуциращи ензими, и микроорганизми, продуциращи антибиотици
Чувствителност към кислород и pH у актиномицети и Bacillus
Антибиотик-продуциращите актиномицети (напр. Streptomyces) и ензим-генериращите штамове Bacillus демонстрират забележителни различия в толерантността към околната среда. Актиномицетите изискват нива на разтворен кислород (DO) над 30 % и pH, близко до неутралното (7,0–7,5), за да осигурят оптимална синтеза на антибиотици като стрептомицин. Актиномицетите имат филаментозна морфология и поради това имат слаба дифузия на кислорода във филаментите. В противоположност на това, штамовете Bacillus обикновено изискват нива на DO между 20 % и 30 % и алкални отклонения (pH 6,5–8,0) по време на производството на протеази. Штамовете Bacillus имат пръчковидна морфология, което води до висока ефективност при усвояването на кислород. Тези физиологични ограничения предоставят информация на проектираните на микробни ферментатори относно проектирането на системата за аерация и pH-стат контролерите.
Тип микроорганизъм Изискване към кислорода Оптимален pH диапазон Продукт
Актиномицети > 30 % насищане с DO 7,0–7,5 Пеницилин, Стрептомицин
Bacillus 20–30 % насищане с DO 6,5–8,0 Протеази, Амилази
Динамика на образуване на продукти, свързани и несвързани с растежа
Продукцията на ензими (рекомбинантни протеази) е силно свързана с растежа и достига максимум по време на експоненциалната фаза, когато има интензивно поглъщане на хранителни вещества и, съответно, по-висок метаболитен изход. Повечето (над 70 %) от леснодостъпните промишлени ензими се получават от штамове на рода Bacillus по време на експоненциалната фаза на растежа. Производството на антибиотици обаче се осъществява по време на стационарната фаза на цикъла. Стационарната фаза на цикъла се характеризира с вторичен метаболизъм, който не е свързан с растежа. В тази фаза филаментозните бактерии (напр. актиномицети)
Конструктивни особености на микробни ферментатори за максимизиране на производството на антибиотици
Конструиране на ферментатори за производство на пеницилин G и стрептомицин
За синтеза на антибиотици е необходимо околната среда за ферментация на актиномицети да отговаря на изключително високи изисквания. При синтеза на пеницилин (G-синтез) разтвореният кислород трябва да надвишава 30 % от наситеността, докато при стрептомицин разтвореният кислород трябва да се поддържа на ниво под 20 %, което може да доведе до намаляване на добива с 40–60 % (BioProcessing Journal, 2023). Метаболитният процес на пеницилина спира при pH между 6,5 и 7,0. При pH над 7,8–8,2 спира и метаболитният процес на стрептомицина. Съвременните ферментатори преодоляват предизвикателството за поддържане на подходящо ниво на кислород чрез комбинирано използване на турбинни импелери и системи за разпръскване (спарджинг). Ферментаторите са оборудвани с интегрирани автоматизирани зонди, които могат да коригират самостоятелно pH чрез добавяне на CO₂ или основа, за да се предотврати рязкото падане на pH вследствие натрупването на органични киселини.
Разширение на вторичния метаболизъм чрез преминаване към партиден режим
Образуването на антибиотици протича в крайната стадия на вторичния метаболизъм по време на стационарната фаза. Синтезът на пеницилин и G се осъществява, когато концентрацията на глюкоза се поддържа под 0,5 г/л, за да се предотврати прекъсването на биосинтетичните пътища. Фазата на производство се удължава с повече от 40–60 часа, докато добивът нараства до 50 % спрямо традиционната партидна технология. Натрупват се странични продукти от ферментационния процес, които могат да окажат неблагоприятно въздействие върху процеса. Основният фокус е върху синтеза на антибиотиците, а клетъчната енергия се насочва към този синтез.
Най-добри практики за конфигуриране на микробни ферментатори при производството на терапевтични ензими
Конструкция на импелери с ниско срязващо усилие и стратегии за поддържане на рН (pH-stat) за осигуряване на стабилността на рекомбинантните протеази
При производството на терапевтични ензими, като например рекомбинантни протеази, са необходими специализирани конфигурации на ферментатори, за да се избегне структурна деградация. Конструкции на ниско-смукателни импелери, като например импелери с наклонени лопатки и хидрофойлни импелери, добре осигуряват, че протеините няма да се денатурират, и помагат да се избегне загуба на протеазна активност. Системата за pH-стат контрол, която поддържа pH-диапазона при 6,5–7,5 за протеазите чрез автоматично регулиране на количествата киселина и основа, е задължително допълнение към системата. При лошо регулиране на pH-то конформационните промени в pH-то силно потискат протеазната активност, потенциално дори с 50 % само за един цикъл. Ако тези две системи се използват заедно, те значително увеличават добива и гарантират, че продуктът отговаря на зададените регулаторни изисквания за отрасъла.
Избор на подходящия тип микробен ферментатор за даден мащаб, правна рамка и резултат
Изборът на подходящия микробиологичен ферментатор е триизмерно съвпадение между мащаба на производството, правните ограничения и характеристиките на желания изходен продукт. На най-ниските нива на производство научните изследвания и пилотните проекти използват малки, модулни системи, а на най-високите нива изследванията върху промишленото производство на антибиотици използват големи механично разбърквани резервоари с автоматично стерилизиране, за да отговарят на многобройните изисквания, предявявани към съвременните фармацевтични продукти. На най-високите нива на изходна мощност производството на терапевтични ензими с висока стойност и метаболити, които могат да се произвеждат в големи количества, се различава по отношение на използването на импелери с ниско срязващо усилие и турбини на Ръштън с висок пренос на кислород съответно. Данните показват, че в 34 % от случаите неуспешния технологичен трансфер от научни проекти към производство се дължи на лошо съвпадение между мащаба и технологията, което води до провал на ферментационните проекти. Може да се каже с основание, че успешната реализация силно зависи от съответствието, добивите и експлоатационната ефективност, които са проектирани в системата още в ранните ѝ етапи.
Често задавани въпроси
Какви екологични фактори влияят върху производството на антибиотици и ензими?
За биосинтезата на антибиотици актиномицетите разчитат на достатъчно разтворен кислород (>30 % наситеност) и неутрален pH от 7,0–7,5. Штамовете от рода Bacillus, които произвеждат ензими, предпочитат умерени нива на разтворен кислород (20–30 %) и алкална среда с pH от 6,5–8,0.
Каква е разликата между производството, свързано с растежа, и производството, несвързано с растежа?
Производството, свързано с растежа, е производството на микробни ензими, което протича по време на експоненциалната фаза, докато производството на антибиотици, което протича по време на стационарната фаза, е пример за производство, несвързано с растежа.
Кои конфигурации на ферментатори осигуряват високопродуктивно производство на антибиотици?
Ферментаторите с механично разбъркване, оборудвани с турбинни импелери (в комбинация с добро регулиране на DO/pH), са най-добрата ви опция за производството на антибиотици като пеницилин и стрептомицин. Най-големите увеличения в добива се постигат чрез фид-батч стратегии, които удължават стационарната фаза на производство.
Как е проектиран ферментаторът за производството на терапевтични ензими?
При производството на терапевтични ензими се използват импелери с ниско срязващо усилие, за да се избегне денатурацията на белтъците. Освен това, за поддържане на стабилността на ензима в pH-диапазона от 6,5 до 7,5, се използва напреднала pH-стат система.
Защо изборът на ферментатор за микробния процес е важен?
Изборът на ферментатори е тясно свързан с мащаба на производството, логичното разглеждане на изхода от процеса и производството на стъпките, предназначени за пазара, при спазване на регулаторните ограничения.