Osnovne fiziološke razlike med mikroorganizmi, ki proizvajajo encime, in tistimi, ki proizvajajo antibiotike
Občutljivost Actinomycetes in Bacillusa na kisik in pH
Antibiotike proizvajajoči aktinomiceti (npr. Streptomyces) in encime proizvajajoče seve Bacillus kažejo opazne razlike v toleranci na okoljske pogoje. Aktinomiceti potrebujejo koncentracijo raztopljenega kisika (DO) nad 30 % in pH blizu nevtralnosti (7,0–7,5), da bi zagotovili najboljšo sintezo antibiotikov, kot je streptomycin. Aktinomiceti imajo nitasto obliko in zato slabo difuzijo kisika skozi niti. Nasprotno pa sevi Bacillus običajno zahtevajo koncentracijo DO med 20–30 % ter alkalne premike (pH 6,5–8,0) med proizvodnjo proteaz. Sevi Bacillus imajo palčaste oblike, kar omogoča visoko učinkovitost absorpcije kisika. Ti fiziološki omejitveni dejavniki ponujajo pomembne informacije oblikovalcem mikrobioloških fermentorjev glede načrtovanja sistema za prezračevanje in regulatorjev pH.
Vrsta mikroorganizma Zahteva kisik Optimalno območje pH Proizvod
Aktinomiceti > 30 % nasičenosti DO 7,0–7,5 Penicilin, streptomycin
Bacillus 20–30 % nasičenosti DO 6,5–8,0 Proteaze, amilaze
Dinamika nastajanja izdelkov, povezana z rastjo in ne povezana z rastjo
Proizvodnja encimov (rekombinantih proteaz) je močno povezana z rastjo in doseže vrhunec v eksponentni fazi, ko pride do intenzivnega vzvzema hranil ter posledično do močnejšega metabolnega izida. Večina (več kot 70 %) industrijsko na voljo dostopnih encimov izvira iz sevov rodu Bacillus v eksponentni fazi rasti. Proizvodnja antibiotikov pa poteka v stacionarni fazi cikla. Stacionarna faza cikla je značilna po metabolizmu, ki ni povezan z rastjo, in predstavlja sekundarni metabolizem. V tej fazi filamentozne bakterije (npr. aktinomycete)
Konstrukcijske značilnosti mikrobioloških fermentorjev za maksimiranje izida antibiotikov
Konstrukcija fermentorjev za proizvodnjo penicilina G in streptomicina
Za sintezo antibiotikov mora biti okoljski proces fermentacije aktinomicetov zelo zahteven. Pri sintezi penicilina (G) mora biti raztopljena kisikova koncentracija večja od 30 % nasičenja, medtem ko pri streptomicinu mora biti raztopljena kisikova koncentracija nadzorovana na manj kot 20 %, kar lahko povzroči zmanjšanje donosa za 40–60 % (BioProcessing Journal, 2023). Proces presnove penicilina se ustavi pri pH 6,5 do 7,0. Nad pH 7,8 do 8,2 se ustavi tudi proces presnove streptomicina. Sodobni fermentorji rešujejo izziv ohranjanja ustrezne koncentracije kisika z uporabo turbine s krilci in sistemov za razprševanje plinov. Fermentorji uporabljajo integrirane avtomatizirane sonde, ki se same popravljajo tako, da dodajo CO₂ ali bazo, da preprečijo padec pH-ja zaradi nabiranja organskih kislin.
Razširitve sekundarne presnove z menjavo na neprekinjen način
Obrazovanje antibiotikov poteka v končni fazi sekundarne presnove v stacionarni fazi. Sintezo penicilina G izvajamo, ko je koncentracija glukoze ohranjena na manj kot 0,5 g/L, da se prepreči motnja v sintezi biosintetičnih poti. Faza proizvodnje se podaljša za več kot 40–60 ur, medtem ko se izkoristek poveča do 50 % v primerjavi z običajno enostavno (batch) metodo. Stranski produkti fermentacijskega procesa se kopičijo in lahko škodujejo obratovanju. Glavna pozornost je usmerjena v sintezo antibiotikov, energija celic pa se usmerja v to sintezo.
Najboljše prakse pri konfiguraciji mikrobioloških fermentorjev za proizvodnjo terapevtskih encimov
Zasnovan z nizkim strižnim učinkom mešalnik in strategije pH-stat za ohranjanje stabilnosti rekombinantnih proteaz
Pri izdelavi terapevtskih encimov, kot so rekombinantni proteaze, so za preprečevanje strukturne degradacije potrebne posebne konfiguracije fermentorjev. Impelerski dizajni z nizkim strižnim obremenitvam, kot so lopatice pod kotom in hidrofilni impelerji, dobro zagotavljajo, da se beljakovine ne denaturirajo, kar pomaga izogniti izgubi aktivnosti proteaz. Sistem za nadzor pH po načelu pH-stat, ki avtomatsko prilagaja količine kisline in baze za ohranjanje pH v razponu 6,5–7,5 za proteaze, je nujna dodatna oprema sistema. Če ni dobro nadzorovan pH, pride do konformacijskih sprememb, povezanih s pH, kar močno zmanjša aktivnost proteaz – celo za 50 % v enem samem ciklu. Če se ti dve sistemi uporabita skupaj, se izkoristek znatno poveča in zagotovi se skladnost izdelka z uveljavljenimi industrijskimi predpisi.
Izbira ustrezne vrste mikrobnega fermentorja glede na določeno velikost, pravni okvir in želeni rezultat
Izbira pravega mikrobiološkega fermentorja je usklajevanje treh spremenljivk: obsega proizvodnje, zakonskih omejitev in lastnosti zahtevanega izdelka. Na najnižjih ravneh proizvodnje raziskovalni in pilotni projekti uporabljajo majhne modularne sisteme, na najvišjih ravneh pa raziskave industrijske proizvodnje antibiotikov uporabljajo velike mešalne reaktorje z avtomatsko sterilizacijo, da izpolnijo številne zahteve sodobnih farmacevtskih izdelkov. Na najvišjih ravneh izdelave se proizvodnja visoko vrednotenih terapevtskih encimov in masovno proizvedljivih metabolitov razlikuje po uporabi impelerjev z nizkim strižnim obremenitvam in Rushtonovih turbine z visokim prenosom kisika. Podatki kažejo, da je 34 % primerov neuspešnega prenosa tehnologije iz raziskovalnih projektov v proizvodnjo posledica slabe usklajenosti med razmerjem meril in tehnologije, kar vodi do neuspeha fermentacijskih projektov. Varno je reči, da uspešna izvedba v veliki meri temelji na skladnosti, donosu in operativni učinkovitosti, ki so že v zgodnjih fazah oblikovanja sistema zasnovani v sistem.
Pogosto zastavljena vprašanja
Kateri okoljski dejavniki vplivajo na proizvodnjo antibiotikov in encimov?
Za biosintezo antibiotikov aktinomiceti potrebujejo ustrezno raztopljeno kisikovo koncentracijo (>30 % nasičenja) in nevtralno pH vrednost 7,0–7,5. Encime proizvajajoče seve Bacillus pa radeje rastejo pri zmernih koncentracijah raztopljenega kisika (20–30 %) in alkalni pH vrednosti 6,5–8,0.
Kakšna je razlika med rastno povezano in nerastno povezano proizvodnjo?
Rastno povezana proizvodnja je proizvodnja mikrobioloških encimov, ki poteka v eksponentni fazi, medtem ko je proizvodnja antibiotikov, ki poteka v stacionarni fazi, primer nerastno povezane proizvodnje.
Kateri konfiguraciji fermentorjev omogočata visoko donosno proizvodnjo antibiotikov?
Mešani fermentorji s turbinskih mešalci (skupaj z dobro regulacijo DO/pH) so najboljša izbira za proizvodnjo antibiotikov, kot sta penicilin in streptomycin. Največje povečanje donosa zagotavljajo strategije s hranjenjem v delih (fed-batch), ki podaljšajo stacionarno fazo proizvodnje.
Kako je fermentor zasnovan za proizvodnjo terapevtskih encimov?
Pri proizvodnji terapevtskih encimov se za preprečevanje denaturacije beljakovin uporabljajo mešalniki z nizkim strižnim obremenitvam. Poleg tega se za ohranjanje stabilnosti encima v pH razponu od 6,5 do 7,5 uporablja napreden sistem za regulacijo pH.
Zakaj je izbira fermentorja za mikrobni proces pomembna?
Izbira fermentorjev je tesno povezana z obsegom proizvodnje, logično oceno izhodne količine procesa ter proizvodnjo tržnih korakov z regulativnimi omejitvami.