تفاوتهای فیزیولوژیک اصلی بین میکروارگانیسمهای تولیدکننده آنزیم و آنتیبیوتیک
حساسیت اکتینومیستها و باسیلوس نسبت به اکسیژن و pH
آکتینومیستهای تولیدکننده آنتیبیوتیک (مانند استرپتومایسس) و سویههای باسیلوس تولیدکننده آنزیم تفاوتهای قابل توجهی در تحمل محیطی نشان میدهند. آکتینومیستها برای دستیابی به بهترین سنتز آنتیبیوتیکهایی مانند استرپتومایسین، نیازمند سطوح اکسیژن محلول (DO) بالاتر از ۳۰٪ و pH نزدیک به خنثی (۷٫۰ تا ۷٫۵) هستند. آکتینومیستها دارای مورفولوژی فیلامنتی (رشتهای) بوده و بنابراین انتشار اکسیژن درون رشتهها ضعیف است. در مقابل، سویههای باسیلوس تمایل دارند که در حین تولید پروتئازها، سطح DO بین ۲۰ تا ۳۰٪ و pH به سمت قلیاییتر شدن (۶٫۵ تا ۸٫۰) تغییر کند. سویههای باسیلوس دارای مورفولوژی میلهای هستند که منجر به کارایی بالای جذب اکسیژن میشود. این محدودیتهای فیزیولوژیکی اطلاعاتی ارزشمند برای طراحان فرمنتورهای میکروبی در زمینه طراحی سیستم هوادهی و کنترلکنندههای pH-stat فراهم میکنند.
نوع میکروارگانیسم نیاز به اکسیژن محدوده pH بهینه محصول
آکتینومیستها اشباع DO بیش از ۳۰٪ ۷٫۰–۷٫۵ پنیسیلین، استرپتومایسین
باسیلوس اشباع DO ۲۰–۳۰٪ ۶٫۵–۸٫۰ پروتئازها، آمیلازها
دینامیکهای تشکیل محصول مرتبط با رشد و غیرمرتبط با رشد
تولید آنزیمها (پروتئازهای ترکیبی) بهطور قوی با رشد مرتبط است و در فاز نمایی به اوج خود میرسد، زمانی که جذب مواد مغذی بهطور قوی انجام میشود و در نتیجه خروجی متابولیکی نیز افزایش مییابد. اکثر آنزیمهای صنعتی موجود در دسترس (بیش از ۷۰ درصد) از سوی سویههای باسیلوس در فاز نمایی رشد تولید میشوند. با این حال، تولید آنتیبیوتیکها در فاز ایستا چرخه انجام میشود. فاز ایستا چرخه با متابولیسم ثانویه غیرمرتبط با رشد مشخص میشود. در این فاز، باکتریهای رشتهای (مانند آکتینوم)
ویژگیهای طراحی فرمنتورهای میکروبی برای بیشینهسازی خروجی آنتیبیوتیکها
طراحی فرمنتورها برای تولید پنیسیلین G و استرپтомایسین
برای سنتز آنتیبیوتیکها، فرآیند محیطی تخمیر اکتینومیستها باید بسیار دقیق و سختگیرانه باشد. برای سنتز پنیسیلین به روش G، میزان اکسیژن محلول باید بیش از ۳۰ درصد اشباع باشد؛ در حالی که برای استرپтомایسین، میزان اکسیژن محلول باید کمتر از ۲۰ درصد نگه داشته شود که این امر ممکن است منجر به کاهش ۴۰ تا ۶۰ درصدی بازده تولید شود. (نشریه بیوپروسسینگ، ۲۰۲۳). فرآیند متابولیسم پنیسیلین در محدوده pH بین ۶٫۵ تا ۷٫۰ متوقف میشود. همچنین فرآیند تولید استرپтомایسین نیز در محدوده pH بالاتر از ۷٫۸ تا ۸٫۲ متوقف میگردد. فرآورندگان مدرن تخمیر با استفاده توأم از توربینهای همزن و سیستمهای پخش گاز (اسپرجینگ) با چالش حفظ سطح مناسب اکسیژن مقابله میکنند. این فرآورندها از پروبهای خودکار یکپارچهای استفاده میکنند که میتوانند بهصورت خودکار با افزودن CO2 یا باز، pH را اصلاح کنند تا از سقوط ناگهانی آن ناشی از تجمع اسیدهای آلی جلوگیری شود.
گسترش متابولیسم ثانویه از طریق تغییر حالت دفعی (باتچ)
تشکیل آنتیبیوتیکها در مرحله پایانی متابولیسم ثانویه و در فاز ایستا رخ میدهد. سنتز پنیسیلین و G زمانی انجام میشود که غلظت گلوکز در سطحی کمتر از ۰٫۵ گرم بر لیتر نگه داشته شود تا از اختلال در مسیرهای بیوسنتزی جلوگیری شود. فاز تولید به مدت بیش از ۴۰ تا ۶۰ ساعت امتداد مییابد، در حالی که بازده تولید نسبت به روش دستهای سنتی تا ۵۰٪ افزایش مییابد. محصولات جانبی فرآیند تخمیر تجمع یافته و ممکن است بر عملیات تأثیر منفی بگذارند. تمرکز اصلی بر سنتز آنتیبیوتیکهاست و انرژی سلولی صرف این سنتز میشود.
بهترین روشهای پیکربندی فرمنتورهای میکروبی برای تولید آنزیمهای درمانی
طراحی همزن با برش کم و استراتژیهای pH-Stat برای حفظ پایداری پروتئاز ترکیبی
هنگام تولید آنزیمهای درمانی مانند پروتئازهای ریکامبینانت، نیاز به پیکربندیهای خاص فرمنتور است تا از تخریب ساختاری جلوگیری شود. طراحیهای همزن کمبرش مانند همزنهای تیغهدار و همزنهای هیدروفویل در حفظ ساختار پروتئینها و جلوگیری از دناتورهشدن آنها مؤثرند و به حفظ فعالیت پروتئازها کمک میکنند. سیستم کنترل pH-stat که با تنظیم خودکار مقادیر اسید و باز، محدوده pH را برای پروتئازها در بازه ۶٫۵ تا ۷٫۵ نگه میدارد، افزودنی ضروریای برای این سیستم محسوب میشود. در صورت کنترل نادرست pH، تغییرات پیکربندی ناشی از pH رخ داده و فعالیت پروتئازها بهطور قابلتوجهی کاهش مییابد؛ این کاهش ممکن است حتی در یک چرخه کامل به ۵۰٪ برسد. اگر این دو سیستم بهصورت ترکیبی استفاده شوند، بازده تولید بهطور چشمگیری افزایش یافته و اطمینان حاصل میشود که محصول نهایی با مقررات اعمالشده در این صنعت سازگار است.
انتخاب نوع مناسب فرمنتور میکروبی بر اساس مقیاس مورد نظر، چارچوب قانونی و نتیجه مطلوب
انتخاب فرآورنده میکروبی مناسب، همترازسازی سه متغیرِ مقیاس تولید، محدودیتهای قانونی و ویژگیهای خروجی مورد نیاز است. در پایینترین سطوح تولید، پروژههای تحقیقاتی و آزمایشی از سیستمهای کوچک و ماژولار استفاده میکنند؛ و در بالاترین سطوح، تحقیقات انجامشده بر روی تولید صنعتی آنتیبیوتیکها از راکتورهای بزرگ با همزن مجهز به استریلسازی خودکار بهمنظور تأمین نیازهای متعدد داروهای مدرن استفاده میکنند. در بالاترین سطوح خروجی، تولید آنزیمهای درمانی با ارزش بالا و متابولیتهای قابل تولید انبوه بهترتیب با استفاده از توربینهای چرخان با تنش برشی پایین و توربینهای راشتون با انتقال اکسیژن بالا مقایسه میشوند. دادهها نشان میدهند که ۳۴٪ از موارد ناموفقیت در انتقال فناوری از پروژههای تحقیقاتی به مرحله تولید، ناشی از عدم تطابق مناسب بین مقیاس تولید و فناوری مربوطه است که منجر به شکست پروژههای تخمیر میشود. میتوان با اطمینان گفت که موفقیت در اجرای این سیستمها بهطور قابلتوجهی وابسته به انطباق، بازده و کارایی عملیاتی طراحیشده در سیستم در مراحل اولیه است.
سوالات متداول
چه عوامل محیطی بر تولید آنتیبیوتیکها و آنزیمها تأثیر میگذارند؟
برای بیوسنتز آنتیبیوتیکها، آکتینومیستها به اکسیژن محلول کافی (بیش از ۳۰٪ اشباع) و pH خنثی در محدوده ۷٫۰ تا ۷٫۵ وابستهاند. سویههای باسیلوس تولیدکننده آنزیم ترجیحاً سطوح متوسط اکسیژن محلول (۲۰ تا ۳۰٪) و pH قلیایی در محدوده ۶٫۵ تا ۸٫۰ را ترجیح میدهند.
تفاوت بین تولید وابسته به رشد و تولید غیروابسته به رشد چیست؟
تولید وابسته به رشد، تولید آنزیمهای میکروبی است که در فاز نمایی رخ میدهد، در حالی که تولید آنتیبیوتیکها که در فاز ایستایی انجام میشود، نمونهای از تولید غیروابسته به رشد است.
چه پیکربندیهای فرمنتوری منجر به تولید با بازده بالا از آنتیبیوتیکها میشوند؟
فرمنتورهای همزندار مجهز به پروانههای توربینی (همراه با کنترل دقیق اکسیژن محلول و pH) بهترین انتخاب برای تولید آنتیبیوتیکهایی مانند پنیسیلین و استرپтомایسین هستند. راهبردهای تغذیهای دفعهای (fed-batch) که فاز تولید ایستایی را امتداد میدهند، بیشترین افزایش در بازده را فراهم میکنند.
فرمنتور چگونه برای تولید آنزیمهای درمانی طراحی میشود؟
در تولید آنزیمهای درمانی، از پروانههای کمبرش برای جلوگیری از دناتوراسیون پروتئینها استفاده میشود. همچنین، برای حفظ پایداری آنزیم در محدوده pH بین ۶٫۵ تا ۷٫۵، از سیستم پیشرفته pH-stat بهره گرفته میشود.
چرا انتخاب فرمنتور برای فرآیند میکروبی اهمیت دارد؟
انتخاب فرمنتور ارتباط قویای با مقیاس تولید، در نظر گرفتن منطقی خروجی فرآیند و تولید مراحل بازارپذیر با محدودیتهای نظارتی دارد.