Βασικές φυσιολογικές διαφορές μεταξύ μικροοργανισμών που παράγουν ένζυμα και μικροοργανισμών που παράγουν αντιβιοτικά
Ευαισθησία σε οξυγόνο και pH μεταξύ ακτινομυκητών και Bacillus
Οι ακτινομυκήτες που παράγουν αντιβιοτικά (π.χ. Streptomyces) και οι στελέχη Bacillus που παράγουν ενζύμα εμφανίζουν σημαντικές διαφορές όσον αφορά την ανοχή τους στο περιβάλλον. Οι ακτινομυκήτες απαιτούν επίπεδα διαλυμένου οξυγόνου (DO) πάνω από 30% και pH κοντά στην ουδετερότητα (7,0 έως 7,5) για να επιτύχουν τη βέλτιστη σύνθεση αντιβιοτικών όπως η στρεπτομυκίνη. Οι ακτινομυκήτες έχουν μυκητοειδή μορφολογία και συνεπώς παρουσιάζουν κακή διάχυση οξυγόνου στα μύκηλα. Αντιθέτως, τα στελέχη Bacillus τείνουν να λειτουργούν σε επίπεδα DO μεταξύ 20–30% και σε αλκαλικές μετατοπίσεις pH (6,5–8,0) κατά την παραγωγή πρωτεασών. Τα στελέχη Bacillus παρουσιάζουν ραβδόμορφη μορφολογία, με αποτέλεσμα υψηλή αποδοτικότητα στην πρόσληψη οξυγόνου. Αυτοί οι φυσιολογικοί περιορισμοί παρέχουν σημαντικές πληροφορίες στους σχεδιαστές μικροβιακών ζυμωτήρων, σχετικά με το σχεδιασμό του συστήματος αερισμού και των ελεγκτών pH.
Τύπος μικροοργανισμού Απαίτηση σε οξυγόνο Βέλτιστο εύρος pH Προϊόν
Ακτινομυκήτες > 30% κορεσμός DO 7,0–7,5 Πενικιλίνη, Στρεπτομυκίνη
Bacillus 20–30% κορεσμός DO 6,5–8,0 Πρωτεάσες, Αμυλάσες
Δυναμική σχηματισμού προϊόντων συνδεδεμένη με την ανάπτυξη και μη συνδεδεμένη με την ανάπτυξη
Η παραγωγή ενζύμων (ανασυνδυασμένων πρωτεασών) συνδέεται στενά με την ανάπτυξη και φθάνει στο μέγιστό της κατά την εκθετική φάση, όταν παρατηρείται έντονη κατανάλωση θρεπτικών ουσιών και, κατά συνέπεια, αυξημένη μεταβολική παραγωγή. Το μεγαλύτερο μέρος (πάνω από 70%) των εύκολα διαθέσιμων βιομηχανικών ενζύμων προέρχεται από στελέχη Bacillus κατά την εκθετική φάση της ανάπτυξης. Η παραγωγή αντιβιοτικών, αντιθέτως, πραγματοποιείται κατά τη στάσιμη φάση του κύκλου. Η στάσιμη φάση του κύκλου χαρακτηρίζεται από μεταβολισμό δευτερεύοντος τύπου, ο οποίος δεν συνδέεται με την ανάπτυξη. Σε αυτήν τη φάση, οι νηματοειδείς βακτηρίδιοι (π.χ., actinom
Χαρακτηριστικά σχεδιασμού μικροβιακών ζυμωτήρων για τη μεγιστοποίηση της παραγωγής αντιβιοτικών
Σχεδιασμός ζυμωτήρων για την παραγωγή πενικιλλίνης G και στρεπτομυκίνης
Για τη σύνθεση αντιβιοτικών, η περιβαλλοντική διαδικασία ζύμωσης των ακτινομυκήτων πρέπει να είναι ιδιαίτερα απαιτητική. Για τη σύνθεση πενικιλίνης (G), η διαλυμένη οξυγόνο πρέπει να υπερβαίνει το 30% της κορεσμένης τιμής, ενώ για τη στρεπτομυκίνη η διαλυμένη οξυγόνο πρέπει να διατηρείται σε επίπεδο χαμηλότερο του 20%, γεγονός που μπορεί να προκαλέσει μείωση της απόδοσης κατά 40–60%. (BioProcessing Journal, 2023). Η μεταβολική διαδικασία της πενικιλίνης σταματά σε pH 6,5 έως 7,0. Πέραν του pH 7,8 έως 8,2, σταματά επίσης και η μεταβολική διαδικασία της στρεπτομυκίνης. Οι σύγχρονοι ζυμωτήρες αντιμετωπίζουν την πρόκληση της διατήρησης κατάλληλων επιπέδων οξυγόνου με την ταυτόχρονη χρήση τουρμπο-αναδευτήρων και συστημάτων αερισμού (sparging). Οι ζυμωτήρες χρησιμοποιούν ενσωματωμένους αυτόματους αισθητήρες οι οποίοι μπορούν να διορθώνουν αυτόματα το pH προσθέτοντας CO₂ ή βάση, προκειμένου να αποφευχθεί η ραγδαία πτώση του λόγω συσσώρευσης οργανικού οξέος.
Επεκτάσεις του δευτερεύοντος μεταβολισμού μέσω της μετάβασης από τη λειτουργία σε παρτίδες
Η δημιουργία αντιβιοτικών λαμβάνει χώρα στο τελικό στάδιο του δευτερεύοντος μεταβολισμού, κατά τη φάση στασιμότητας. Η σύνθεση πενικιλίνης και G πραγματοποιείται όταν η συγκέντρωση γλυκόζης διατηρείται σε επίπεδο κάτω των 0,5 g/L, προκειμένου να αποφευχθεί η διακοπή των βιοσυνθετικών διαδρομών. Η φάση παραγωγής επεκτείνεται κατά περισσότερο από 40–60 ώρες, ενώ η απόδοση αυξάνεται έως και κατά 50% σε σύγκριση με την παραδοσιακή παρτίδα. Συσσωρεύονται παραπροϊόντα της ζυμωτικής διαδικασίας, τα οποία ενδέχεται να είναι επιζήμια για τη λειτουργία. Η σύνθεση των αντιβιοτικών αποτελεί το κύριο επίκεντρο ενδιαφέροντος, ενώ η ενέργεια των κυττάρων κατευθύνεται προς τη σύνθεση.
Καλύτερες πρακτικές διαμόρφωσης μικροβιακών ζυμωτήρων για την παραγωγή θεραπευτικών ενζύμων
Σχεδιασμός αναδευτήρα χαμηλής διάτμησης και στρατηγικές pH-Stat για τη διατήρηση της σταθερότητας ανασυνδυασμένης πρωτεάσης
Κατά την παρασκευή θεραπευτικών ενζύμων, όπως οι ανασυνδυασμένες πρωτεάσες, απαιτούνται ειδικές διαμορφώσεις ζυμωτήρων για να αποφευχθεί η δομική καταστροφή. Οι σχεδιασμοί πτερυγίων χαμηλής διάτμησης, όπως τα πτερύγια με κλίση και τα υδροφτερύγια, είναι αποτελεσματικοί στη διασφάλιση ότι οι πρωτεΐνες δεν αναδιπλώνονται και συμβάλλουν στην αποφυγή απώλειας δραστικότητας των πρωτεασών. Ένα σύστημα ελέγχου pH-stat, το οποίο διατηρεί το εύρος pH στα 6,5–7,5 για τις πρωτεάσες ρυθμίζοντας αυτόματα τις ποσότητες οξέος και βάσης, αποτελεί αναγκαία προσθήκη στο σύστημα. Όταν το pH δεν ελέγχεται επαρκώς, προκαλούνται συγκεντρωτικές αλλαγές στη σύσταση του pH και η δραστικότητα των πρωτεασών αποθαρρύνεται σημαντικά, ενδεχομένως ακόμη και κατά 50 % κατά τη διάρκεια ενός μόνο κύκλου. Εάν αυτά τα δύο συστήματα χρησιμοποιηθούν από κοινού, αυξάνουν σημαντικά την απόδοση και διασφαλίζουν ότι το προϊόν συμμορφώνεται με τους ισχύοντες κανονισμούς του κλάδου.
Επιλογή του κατάλληλου τύπου μικροβιακού ζυμωτήρα για δεδομένη κλίμακα, νομικό πλαίσιο και αποτέλεσμα
Η επιλογή του κατάλληλου μικροβιακού ζυμωτήρα αποτελεί ευθυγράμμιση τριών μεταβλητών: της κλίμακας παραγωγής, των νομικών περιορισμών και των χαρακτηριστικών του απαιτούμενου προϊόντος. Στα χαμηλότερα επίπεδα παραγωγής, οι έρευνες και τα πιλοτικά έργα χρησιμοποιούν μικρά, ενότητες μοντουλαρικών συστημάτων, ενώ στα υψηλότερα επίπεδα, η έρευνα για τη βιομηχανική παραγωγή αντιβιοτικών χρησιμοποιεί μεγάλους ανακατευόμενους δεξαμενοειδείς αντιδραστήρες με αυτόματη αποστείρωση, προκειμένου να ικανοποιηθούν οι πολλαπλές απαιτήσεις των σύγχρονων φαρμακευτικών προϊόντων. Στα υψηλότερα επίπεδα παραγωγής, η παραγωγή ενζύμων θεραπευτικής υψηλής αξίας και η παραγωγή μεταβολιτών σε μεγάλες ποσότητες αντιπαρατίθενται με τη χρήση αναδευτήρων χαμηλής διάτμησης και των τουρμπινών Rushton υψηλής μεταφοράς οξυγόνου, αντίστοιχα. Δεδομένα υποστηρίζουν ότι το 34% των περιπτώσεων αποτυχημένης μεταφοράς τεχνολογίας από ερευνητικά έργα σε παραγωγικά συστήματα οφείλεται σε κακή αντιστοίχιση κλίμακας-τεχνολογίας, η οποία οδηγεί στην αποτυχία των ζυμωτικών έργων. Είναι ασφαλές να δηλωθεί ότι η επιτυχής υλοποίηση εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη συμμόρφωση, την απόδοση και τη λειτουργική αποδοτικότητα που σχεδιάζονται στο σύστημα κατά τις πρώιμες φάσεις.
Συχνές Ερωτήσεις
Ποιοι παράγοντες του περιβάλλοντος επηρεάζουν την παραγωγή αντιβιοτικών και ενζύμων;
Για τη βιοσύνθεση αντιβιοτικών, οι ακτινομυκήτες εξαρτώνται από επαρκές διαλυμένο οξυγόνο (>30% κορεσμός) και ουδέτερο pH 7,0–7,5. Οι στελέχη Bacillus που παράγουν ένζυμα προτιμούν μέτρια επίπεδα διαλυμένου οξυγόνου (20–30%) και αλκαλικό pH 6,5–8,0.
Ποια είναι η διαφορά μεταξύ παραγωγής συνδεδεμένης με την ανάπτυξη και παραγωγής μη συνδεδεμένης με την ανάπτυξη;
Η παραγωγή συνδεδεμένη με την ανάπτυξη είναι η παραγωγή μικροβιακών ενζύμων, η οποία λαμβάνει χώρα κατά την εκθετική φάση, ενώ η παραγωγή αντιβιοτικών, η οποία λαμβάνει χώρα κατά τη σταθερή φάση, αποτελεί παράδειγμα παραγωγής μη συνδεδεμένης με την ανάπτυξη.
Ποιες διαμορφώσεις φυτείας οδηγούν σε υψηλή απόδοση παραγωγής αντιβιοτικών;
Οι αναδευόμενοι φυτείες εξοπλισμένοι με τυρβίνες (σε συνδυασμό με αποτελεσματικό έλεγχο του DO/pH) αποτελούν την καλύτερη επιλογή για αντιβιοτικά όπως η πενικιλίνη και η στρεπτομυκίνη. Οι στρατηγικές τροφοδοσίας-παρτίδας (fed-batch), οι οποίες επεκτείνουν τη φάση σταθερής παραγωγής, προσφέρουν τις καλύτερες αυξήσεις στην απόδοση.
Πώς σχεδιάζεται ο αναδότης για την παραγωγή θεραπευτικών ενζύμων;
Στην παραγωγή θεραπευτικών ενζύμων χρησιμοποιούνται αναδότες με χαμηλή διατμητική τάση για να αποφευχθεί η αποφυσιολογικοποίηση των πρωτεϊνών. Επιπλέον, για τη διατήρηση της σταθερότητας του ενζύμου στο pH εύρος 6,5 έως 7,5, χρησιμοποιείται ένα προηγμένο σύστημα pH-stat.
Γιατί είναι σημαντική η επιλογή του αναδότη για τη μικροβιακή διαδικασία;
Η επιλογή των αναδοτών συνδέεται στενά με την κλίμακα παραγωγής, τη λογική αξιολόγηση της παραγόμενης ποσότητας από τη διαδικασία και την παραγωγή των εμπορεύσιμων σταδίων υπό τους περιορισμούς της ρυθμιστικής νομοθεσίας.