Kodėl ištirpusio deguonies valdymas lemia ląstelių gyvybingumą ląstelių kultūros bioreaktoriuose?
DO–gyvybingumo galutinio taško poveikis: netiesiniai atsakai į skirtingus oro sotinimo slenksčius (30 %, 50 % ir 70 %)
Ląstelių gyvybingumas ląstelių kultūros bioreaktoriuje rodo netiesinę reakciją į ištirpusį deguonį (DO), kai žemiau tam tikrų ribų stebimi stiprūs neigiami poveikiai. Nustatyta, kad esant oro sotinimui mažesniam nei 50 %, ląstelių gyvybingumas žymiai sumažėja: esant 30 % oro sotinimui, gyvybingumas sudaro tik 22 % lyginant su 50 % oro sotinimu (Hanson et al., 2022). Be to, padidinus DO nuo 50 % iki 70 % oro sotinimo, gyvybingumo padidėjimas yra nepastebimas – pranešama apie mažesnį nei 5 % gyvybingumo padidėjimą, tuo pat metu didėjant oksidaciniam stresui. Tai rodo, kad egzistuoja siauras optimalus oro sotinimo intervalas – tarp 40 % ir 60 %, kuriame pasiekiamas maksimalus ląstelių gyvybingumas su minimaliu metabolinio disbalanso rizikos lygiu.
DO nustatytasis taškas Atitinkama gyvybingumas Metabolinis poveikis
30 % ⬇️ 78 % Sunkus hipoksijos būvis, ATP trūkumas
50 % ⬆️ 95–100 % Subalansuotas kvėpavimas
70 % ⬇️ 92–97 % Padidėjęs ROS kiekis, DNR fragmentacija
Jei DO lygis išlieka tiksliniame optimaliame diapazone – 40–60 %, tai neleidžia susidaryti energijos krizei ir laisvųjų radikalų sukeliamai žalai.
Fiziologinė pagrindas: hipoksiją imituojantis DO (4–10 % O₂)
DO lygiai, kurie imituoja 4–10 % O₂ (8–20 % oro sotinimo) hipoksiją, atitinka deguonies kiekį audiniuose. Aktyvuojami hipoksiją indukuojantys faktoriai (HIF), o ląstelių metabolizmas keičiamas taip, kad būtų sustiprinta glikolitinė ir antioksidacinė veikla bei sumažintos reaktyviųjų deguonies rūšių (ROS) koncentracijos 40 % palyginti su normoksinės būklės būsenos metu (Semenza et al., 2021). Svarbu pažymėti, kad mitochondrijų kvėpavimas visiškai išlaikomas, ląstelių gyvybingumas ir metabolizmas pagerėja, o pieno rūgšties kiekis sumažėja. Rezultatas – metabolinė pusiausvyra, kai deguonies tiekimas atitinka jos poreikį, todėl išvengiama tiek hipoksinės, tiek hiperoksinės ląstelių mirties.
Jautrūs DO valdymo strategijos:\n\nDO jutikliai: optiniai prieš poliografinius\n\nOptiniai jutikliai patikimai registruoja ištirpusio deguonies (DO) kiekį ±1 % oro sotinumo ribose, su minimaliu nuokrypiu ir kalibravimo reikalavimais. Poliografiniai zondai išlieka pigesnė, tačiau mažiau patikima alternatyva, nes jų nuokrypis siekia nuo 2 % iki 5 %, o kalibravimas turi būti atliekamas 50 % dažniau. Šie pakartotiniai kalibravimai sukelia didelę užteršimo riziką, nes dažnai prarandama mitybos terpė, dėl ko gyvybingumo lygis sumažėja 15 %. DO jutikliai įrodytai yra patikimi ir palaiko DO valdymą, kuris yra būtinas vertingų ląstelių linijų vientisumui išlaikyti kontroliuojamame bioprocese.\n\nUždarosios kilpos valdymas: DO + dujų srauto valdymas\n\nDO valdymas toliau kis kartu su bioprocesų tobulėjimu. Pramoninis standartinis PID valdymas leidžia greitai reaguoti į DO pokyčius. Greičio ir valdymo patobulinimai pastebimi eksponentinio augimo metu, kai biomasa nustato DO nustatytąją reikšmę. „Biotech Control Journal“ (2023) nurodo triskart padidėjusį deguonies pernašos intensyvumą, kai kitos parametrai lieka nekintantys, o gyvybingumas sumažėja mažiau nei 5 %.
Deguonies pernašos efektyvumo maksimizavimas: KLa optimizavimas ląstelių kultūros bioreaktoruose
Kūno svyravimo dažnio, kampo ir pripildymo įtaka masės pernašai ir ląstelių gyvybingumui vienkartinio naudojimo bioreaktoruose
Vienkartinio naudojimo ląstelių kultūros bioreaktoruose KLa (tūrinis deguonies masės pernašos koeficientas skystyje) nustatomas pagal svyravimo dinamiką, o ne maišymą. Kūno svyravimo dažnis, kampas ir pripildymo tūris sąveikauja netiesiniu būdu, veikdami tiek skystojoje terpėje esančio deguonies tiekimą, tiek mechaninę įtampą, kuriai yra veikiamos ląstelės.
- Kūno svyravimo dažnio padidėjimas koreliuoja su eksponentiniu KLa ir, atitinkamai, deguonies tiekimo padidėjimu dėl padidėjusios paviršinės aeracijos. Tačiau dažniu, viršijančiu 25 apsukas per minutę, susidarančios hidrodinaminės nuožulniosios jėgos sukelia ląstelių gyvybingumo praradimą (15–30 %) šiems nuo nuožulniosios jėgos jautriems ląstelių linijoms.
- Didesnis svyravimo kampas (7°–12°) taip pat susijęs su dujų-skysčio paviršiaus ploto padidėjimu. Tačiau šis padidėjimas reikalauja griežto pripildymo tūrio kontrolės, nes per didelis pripildymo tūris (> 40 %) slopina paviršiaus atnaujinimą, o nepakankamas pripildymo tūris (< 20 %) padidina mechaninę įtampą ląstelėms.
- Empiriniai tyrimai parodė, kad 15°–20° svyravimo kampas esant 15–20 apsukų per minutę ir 30–35 % pripildymo tūriui nuolat užtikrina KLa reikšmes 4–10 h⁻¹, išlaikant ląstelių gyvybingumą virš 90 %.
Reikėtų pažymėti, kad nedideliai pokyčiai reikalauja didesnių koriguojančių veiksmų. Pavyzdžiui, 10 % mažesnis pripildymo tūris reikalauja 5–8 % didesnio svyravimo dažnio, kad būtų pasiektas tas pats KLa.
Netikslaus derinimo tiesioginė kaina yra didelė: 2023 m. Ponemon instituto tyrimas nustatė vidutinį nuostolį po $740 000 už kiekvieną partiją dėl nesėkmių, susijusių su netinkama KLa optimizacija.
Dažniausiai užduodami klausimai
K: Koks yra optimalus ištirpusio deguonies lygis ląstelių gyvybingumui bioreaktoriuje?
A: Optimalus ištirpusio deguonies kiekis bioreaktoriuje yra 40–60 % oro sotinimo. Virš 60 % lygio gali įvykti ląstelių mirtis dėl per didelio
K: Kaip optinių jutiklių privalumai palyginti su poliografinių zondų privalumais ištirpusio deguonies stebėjime?
A: Palyginus ištirpusio deguonies stebėjimą abiem metodais, optiniai jutikliai yra žymiai veiksmingesni. Jų matavimų tikslumas yra vidutiniškai 1 %, o dreifavimo rodiklis – apie 0,5 % per mėnesį. Be to, juos reikia kalibruoti kas 6 mėnesius. Kita vertus, optiniai jutikliai yra brangesni. Tačiau poliografinių zondų dreifavimo rodiklis yra apie 2–5 % per mėnesį, o juos reikia perkalinuoti kas savaitę.
K: Kodėl svyravimo dažnis yra kritiškai svarbus vienkartinio naudojimo bioreaktoriams?
A: Vienkartinių bioreaktorių svyravimo dažnis yra pagrindinis masės pernašos skatinimo metodas. Tačiau per didelis svyravimo dažnis gali pažeisti ląsteles. Tai ypač aktualu suspensinėms ląstelėms ir ląstelių linijoms, kurios yra labiau jautrios šlyties jėgoms.
K: Kokie yra pranašumai, taikant OTR kompensavimą iš anksto?
A: OTR kompensavimas iš anksto yra naudingas, nes užtikrina, kad tirpiosios deguonies koncentracija išliktų pakankamai aukšta, kad ląstelės galėtų augti be apribojimų. Pagrindinis bioreaktorių trūkumas yra tai, kad ląstelių augimo greitis gali labai svyruoti. Tai reiškia, kad deguonies lygis gali kriti iki pavojingų reikšmių, jei deguonies tiekimas nebus pakankamas. Matuojant masę