چرا کنترل اکسیژن محلول (DO) بر قابلیت زندهماندن سلولها در بیوراکتورهای فرهنگ سلولی تأثیرگذار است؟
اثر پایانی DO-قابلیت زندهماندن: پاسخهای غیرخطی در سطوح مختلف اشباع هوا (۳۰٪ در مقابل ۵۰٪ در مقابل ۷۰٪)
زیستزندهبودن سلولها در بیوراکتور کشت سلولی، پاسخی غیرخطی به اکسیژن محلول (DO) نشان میدهد و زیر آستانههای خاصی اثرات مخربی دارد. نشان داده شده است که در اشباع هوا زیر ۵۰٪، زیستزندهبودن سلولها بهطور قابلتوجهی کاهش مییابد؛ بهطوریکه در اشباع هوا ۳۰٪، زیستزندهبودن تنها ۲۲٪ در مقایسه با اشباع هوا ۵۰٪ است (هنسن و همکاران، ۲۰۲۲). علاوه بر این، افزایش DO از ۵۰٪ تا ۷۰٪ اشباع هوا منجر به افزایش ناچیزی در زیستزندهبودن میشود — بهگونهای که افزایش گزارششده در زیستزندهبودن سلولها کمتر از ۵٪ است — در حالی که این افزایش همراه با افزایش استرس اکسیداتیو نیز هست. این امر نشان میدهد که پنجرهای کوچک از اشباع هوا بین ۴۰٪ تا ۶۰٪ وجود دارد که در آن حداکثر زیستزندهبودن سلولها با حداقل خطر عدم تعادل متابولیک بهدست میآید.
مقدار تنظیمشده DO — زیستزندهبودن نسبی — تأثیر متابولیک
۳۰٪ ⬇️ ۷۸٪ هیپوکسی شدید، کمبود ATP
۵۰٪ ⬆️ ۹۵–۱۰۰٪ تنفس متعادل
۷۰٪ ⬇️ ۹۲–۹۷٪ افزایش ROS، شکستن DNA
اگر سطح اکسیژن محلول (DO) در محدوده بهینه هدفگذاریشده ۴۰ تا ۶۰ درصد باقی بماند، این امر از بروز بحران انرژی و آسیب ناشی از رادیکالهای آزاد جلوگیری میکند.
پایه فیزیولوژیکی: سطح DO شبیهسازیکننده هیپوکسی (۴ تا ۱۰ درصد O₂)
سطوح DO که هیپوکسی را در محدوده ۴ تا ۱۰ درصد O₂ (معادل ۸ تا ۲۰ درصد اشباع هوایی) شبیهسازی میکنند، با سطوح اکسیژن موجود در بافتها معادل هستند. عوامل القاءشونده هیپوکسی (HIFها) فعال میشوند و متابولیسم سلولی بهگونهای تغییر میکند که عملکرد گلیکولیتیک و آنتیاکسیدانی افزایش یافته و تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS) نسبت به حالت نورموکسیک ۴۰ درصد کاهش مییابد (Semenza و همکاران، ۲۰۲۱). مهمتر اینکه، تنفس میتوکندریایی بهطور کامل حفظ میشود، در حالی که زندهماندن سلولها و متابولیسم سلولی ارتقا یافته و سطح لاکتات کاهش مییابد. نتیجه این است که تعادل متابولیک برقرار میشود؛ یعنی تأمین اکسیژن با نیاز سلولی متناسب است و از مرگ سلولی ناشی از هیپوکسی یا هایپرکسی جلوگیری میشود.
استراتژیهای کنترل هوشمند سطح اکسیژن محلول (DO):\n\nسنسورهای سطح اکسیژن محلول (DO): نوری در مقابل قطبنگاری\n\nسنسورهای نوری سطح اکسیژن محلول (DO) را با دقت ±۱٪ اشباع هوا و با کمترین میزان انحراف و نیاز به کالیبراسیون ثبت میکنند. پروبهای قطبنگاری گزینهای ارزانتر اما کمتر قابل اعتماد هستند، زیرا بین ۲ تا ۵ درصد دچار انحراف میشوند و نیاز به کالیبراسیون مجدد ۵۰ درصد بیشتری دارند. این کالیبراسیونهای مکرر خطر بالایی از آلودگی ایجاد میکنند، چرا که اغلب بخشی از محیط غذایی از بین میرود و منجر به کاهش ۱۵ درصدی قابلیت زندهماندن سلولها میشود. سنسورهای سطح اکسیژن محلول (DO) از نظر قابلیت اطمینان اثبات شدهاند و کنترل سطح اکسیژن محلول (DO) را که برای حفظ یکپارچگی خطوط سلولی ارزشمند در فرآیندهای بیوتکنولوژیکی کنترلشده ضروری است، پشتیبانی میکنند.\n\nکنترل حلقه بسته: کنترل سطح اکسیژن محلول (DO) + جریان گاز\n\nکنترل سطح اکسیژن محلول (DO) بهموازات تحولات فرآیندهای بیوتکنولوژیکی نیز ادامه خواهد یافت. کنترل صنعتی استاندارد PID قادر به پاسخگویی سریع به تغییرات ناگهانی سطح اکسیژن محلول (DO) است. بهبود در سرعت و دقت کنترل در فاز رشد نمایی مشاهده میشود، زمانی که سطح بیومس تعیینکنندهٔ نقطه تنظیم (Setpoint) سطح اکسیژن محلول (DO) است. مجله کنترل بیوتکنولوژی (۲۰۲۳) افزایش سهبرابری در انتقال اکسیژن را در شرایطی که سایر پارامترها ثابت باقی ماندهاند و قابلیت زندهماندن سلولها کمتر از ۵ درصد کاهش یافته است، گزارش کرده است.
بیشینهسازی بازده انتقال اکسیژن: بهینهسازی KLa در بیوراکتورهای کشت سلولی
تأثیرات نرخ تابخوردن، زاویه و حجم پرکننده بر انتقال جرم و زندهمانی در بیوراکتورهای یکبارمصرف
در مورد بیوراکتورهای کشت سلولی یکبارمصرف، KLa (ضریب انتقال جرم حجمی اکسیژن در مایع) توسط دینامیک تابخوردن و نه همزنی تعیین میشود. نرخ تابخوردن، زاویه و حجم پرکننده بهصورت غیرخطی بر عرضه اکسیژن مایع و همچنین تنش مکانیکی واردشده به سلولها تأثیر میگذارند.
- افزایش نرخ تابخوردن با افزایش نمایی KLa و در نتیجه عرضه اکسیژن همراه است، زیرا تهویه سطحی افزایش مییابد. با این حال، در نرخهای بالاتر از ۲۵ دور در دقیقه، برش هیدرودینامیکی ایجادشده منجر به کاهش زندهمانی سلولها (۱۵ تا ۳۰ درصد) در خطوط سلولی حساس به برش میشود.
- زاویه نوسان بیشتر (۷° تا ۱۲°) نیز با افزایش سطح تماس گاز-مایع همبستگی دارد. با این حال، این افزایش نیازمند کنترل دقیق حجم پرکننده است، زیرا حجم پرکننده بیش از حد (> ۴۰٪) تجدید سطحی را مهار میکند، در حالی که حجم پرکننده کم (< ۲۰٪) تنش مکانیکی وارد بر سلولها را افزایش میدهد.
- مطالعات تجربی نشان میدهند که زاویه نوسان ۱۵° تا ۲۰° با نرخ ۱۵ تا ۲۰ دور در دقیقه، همراه با حجم پرکنندهای بین ۳۰ تا ۳۵٪، بهطور مداوم مقادیر KLa را در محدوده ۴ تا ۱۰ h⁻¹ فراهم میکند و قابلیت بقای سلولی را بالاتر از ۹۰٪ حفظ مینماید.
لازم به ذکر است که تغییرات جزئی نیازمند اقدامات اصلاحی بزرگتری هستند. بهعنوان مثال، کاهش ۱۰٪ای در حجم پرکننده، افزایش ۵ تا ۸٪ای در نرخ نوسان را برای دستیابی به همان مقدار KLa لازم میسازد.
عدم تطابق مستقیماً هزینهبر است؛ مطالعهای از مؤسسه پونئوم در سال ۲۰۲۳ گزارش کرده است که متوسط زیان ناشی از شکستهای مرتبط با بهینهسازی نامناسب KLa، معادل ۷۴۰۰۰۰ دلار آمریکا در هر بچ است.
سوالات متداول
پرسش: سطح بهینه اکسیژن محلول برای قابلیت بقای سلول در بیوراکتور چقدر است؟
پاسخ: سطح بهینه اکسیژن محلول در بیوراکتور ۴۰ تا ۶۰ درصد اشباع هوایی است. سطوح بالاتر از ۶۰ درصد ممکن است منجر به مرگ سلولها به دلیل تشکیل بیشازحد
سوال: مزایای سنسورهای نوری در مقایسه با پروبهای قطبنگاری برای پایش اکسیژن محلول چگونه است؟
پاسخ: هنگام مقایسه پایش اکسیژن محلول با این دو روش، سنسورهای نوری بسیار مؤثرتر هستند. دقت اندازهگیری آنها در محدودهٔ ۱ درصد و نرخ دریفت حدود ۰٫۵ درصد در ماه است. علاوه بر این، نیاز به کالیبراسیون هر شش ماه یکبار دارند. از سوی دیگر، سنسورهای نوری گرانتر هستند. با این حال، نرخ دریفت پروبهای قطبنگاری حدود ۲ تا ۵ درصد در ماه است و نیاز به کالیبراسیون مجدد هر هفته دارند.
سوال: چرا نرخ تابخوردن (Rocking Rate) برای بیوراکتورهای تکبار مصرف حیاتی است؟
الف: نرخ نوسان بیوراکتورهای یکبارمصرف روش اصلی برای تسهیل انتقال جرم است. با این حال، نرخهای نوسان بیش از حد میتوانند باعث آسیب به سلولها شوند. این امر بهویژه در مورد سلولهای معلق و خطوط سلولی که به تنش برشی حساستر هستند، صدق میکند.
سوال: مزایای جبرانسازی پیشبین OTR چیست؟
پاسخ: جبرانسازی پیشبین OTR مفید است، زیرا اطمینان حاصل میکند که سطح اکسیژن محلول بهاندازهای بالا باقی میماند تا رشد سلولها بدون محدودیت ادامه یابد. اصلیترین نقطه ضعف بیوراکتورها این است که نرخ رشد سلولی میتواند نوسانات زیادی داشته باشد. این بدان معناست که سطح اکسیژن ممکن است در صورت تأمین ناکافی اکسیژن به سطوح خطرناکی کاهش یابد. با اندازهگیری جرم