Защо контролът на разтворения кислород влияе върху жизнеспособността на клетките в биореакторите за култури на клетки?
Ефект на връзката между DO и жизнеспособност: нелинейни отговори при различни прагови стойности на въздушната наситеност (30 % срещу 50 % срещу 70 %)
Животоспособността на клетките в биореактор за култивиране на клетки проявява нелинейна реакция спрямо разтворения кислород (DO), като показва тежки ефекти под определени прагови стойности. Доказано е, че при насищане с въздух под 50 % жизнеспособността на клетките рязко намалява, като при 30 % насищане с въздух тя е само 22 % спрямо тази при 50 % насищане с въздух (Hanson et al., 2022). Освен това увеличаването на DO от 50 % до 70 % насищане с въздух води до незначително повишаване на жизнеспособността — по-малко от 5 %, докато едновременно се наблюдава повишаване на оксидативния стрес. Това предполага, че съществува тясна оптимална област на насищането с въздух, ограничена между 40 % и 60 %, където се постига максималната жизнеспособност на клетките при минимален риск от метаболитен дисбаланс.
Зададена стойност на DO Относителна жизнеспособност Метаболитно въздействие
30 % ⬇️ 78 % Тежка хипоксия, изчерпване на АТФ
50 % ⬆️ 95–100 % Балансирано дишане
70 % ⬇️ 92–97 % Повишени ROS, фрагментация на ДНК
Ако нивото на разтворен кислород (DO) остане в целевия оптимален диапазон от 40 %–60 %, това предотвратява енергиен кризис и увреждане от свободни радикали.
Физиологична основа: DO, имитиращ хипоксия (4–10 % O₂)
Нивата на DO, които имитират хипоксия от 4–10 % O₂ (8–20 % наситеност с въздух), са еквивалентни на концентрациите на кислород, присъстващи в тъканите. Активират се хипоксия-индуцирани фактори (HIF), а клетъчният метаболизъм се променя, за да се подсилят гликолитичните и антиоксидантните функции и да се намали производството на реактивни форми на кислорода (ROS) с 40 % спрямо нормоксичното състояние (Semenza et al., 2021). От решаващо значение е, че митохондриалното дишане се поддържа напълно, като се подобряват жизнеспособността и метаболизмът на клетките и се намалява нивото на лактат. Резултатът е метаболитен баланс, при който доставката на кислород отговаря на потребностите, като се избягва както хипоксично, така и хипероксично клетъчно увреждане.
Възприемчиви стратегии за контрол на разтворения кислород (DO):\n\nСензори за разтворен кислород (DO): оптични срещу полярографски\n\nОптичните сензори регистрират нивата на разтворен кислород (DO) надеждно в рамките на ±1 % от наситеността с въздух, с минимално отклонение и нужда от калибриране. Полярографските зонди остават по-евтин, но по-малко надежден вариант, тъй като отклоняват между 2 % и 5 % и изискват повторно калибриране с 50 % по-често. Тези повторни калибрирания водят до висок риск от контаминация, тъй като често се губи хранителна среда, което предизвиква стрес, при който жизнеспособността намалява с 15 %. Сензорите за разтворен кислород (DO) са доказали своята надеждност и поддържат контрола на DO, който е от жизнено значение за запазване на цялостта на ценни клетъчни линии при контролирани биопроцеси.\n\nКонтрол с обратна връзка: контрол на DO + контрол на газовия поток\n\nКонтролът на DO ще продължи да се адаптира, докато биопроцесите се развиват. Промишлен стандартен PID контрол позволява бързи промени в нивото на DO. Подобрения в скоростта и точността на контрола се наблюдават по време на експоненциалния растеж, когато нивата на биомасата определят зададената стойност за DO. Според „Biotech Control Journal“ (2023 г.) преносът на кислород се увеличава трикратно при постоянство на другите параметри, а жизнеспособността намалява с по-малко от 5 %.
Максимизиране на ефективността на преноса на кислород: Оптимизация на KLa в биореактори за култивиране на клетки
Влияние на честотата на люлеене, ъгъла и обема на течността върху масовия пренос и жизнеспособността в еднократни биореактори
При еднократните биореактори за култивиране на клетки KLa (обемният коефициент на масов пренос на кислород в течност) се определя от динамиката на люлеенето, а не от разбъркването. Честотата на люлеене, ъгълът и обемът на течността взаимодействат по нелинеен начин, за да повлияят както върху доставката на кислород в течността, така и върху механичното напрежение, на което са изложени клетките.
- Увеличаването на честотата на люлеене води до експоненциално увеличение на KLa и, съответно, на доставката на кислород поради по-интензивно аерирание на повърхността. Въпреки това при честоти над 25 об/мин хидродинамичното срязващо напрежение води до загуба на жизнеспособност на клетките (15–30 %) за клетъчни линии, които са чувствителни към срязващи сили.
- По-голям ъгъл на люлеене (7° – 12°) също корелира с увеличение на повърхността на контакта между газа и течността. Това увеличение обаче изисква строг контрол върху обема на зареждане, тъй като прекалено голям обем на зареждане (> 40 %) потиска обновяването на повърхността, докато недостатъчно зареждане (< 20 %) увеличава механичното напрежение върху клетките.
- Емпирични проучвания показват, че ъгъл на люлеене от 15° – 20° при честота 15–20 об/мин, комбиниран с обем на зареждане от 30–35 %, последователно води до стойности на KLa от 4 – 10 h⁻¹ и поддържа жизнеспособността на клетките над 90 %.
Трябва да се отбележи, че малки промени изискват по-значителни коригиращи действия. Например намаляване на обема на зареждане с 10 % изисква увеличение на скоростта на люлеене с 5 – 8 %, за да се постигне същата стойност на KLa.
Неправилната настройка има директна финансова цена: според проучване на Института Понеон от 2023 г. средната загуба възлиза на 740 000 щ.д. за партида при неуспехи, свързани с лоша оптимизация на KLa.
Често задавани въпроси
В: Какво е оптималното ниво на разтворен кислород за жизнеспособността на клетките в биореактор?
A: Оптималният ниво на разтворен кислород в биореактор е 40 – 60% наситеност с въздух. Нива над 60% могат да доведат до гибел на клетките поради образуването на излишно
В: Какви са предимствата на оптичните сензори в сравнение с полярографските проби за мониторинг на разтворения кислород?
A: При сравнение на мониторинга на разтворения кислород с двата метода оптичните сензори са значително по-ефективни. Тяхната измервателна точност е в рамките на 1 %, а скоростта на дрейф е около 0,5 % на месец. Освен това те се калибрират веднъж на всеки 6 месеца. От друга страна, оптичните сензори са по-скъпи. Скоростта на дрейф на полярографските проби обаче е около 2–5 % на месец, а те трябва да се калибрират отново всяка седмица.
В: Защо скоростта на люлеене е критична за еднократните употреба биореактори?
А: Честотата на люлеене на еднократните биореактори е основният метод за подобряване на масовия пренос. Високите честоти на люлеене обаче могат да причинят увреждане на клетките. Това е особено вярно за суспензионните клетки и клетъчните линии, които са по-чувствителни към смачкване.
В: Какви са предимствата на компенсацията на OTR по метода feedforward?
А: Компенсацията на OTR по метода feedforward е полезна, тъй като осигурява, че концентрацията на разтворен кислород остава достатъчно висока, за да поддържа растежа на клетките без ограничения. Основният недостатък на биореакторите е, че скоростта на клетъчен растеж може значително да се променя. Това означава, че нивата на кислород могат да спаднат до опасни стойности при липса на достатъчно количество кислород. Чрез измерване на масата