Zakaj nadzor raztopljene kisikove koncentracije vpliva na življivost celic v bioreaktorjih za kulturo celic?
Učinek DO–življivost kot končna točka: nelinearni odzivi pri različnih pragovih zasičenja z zrakom (30 %, 50 % in 70 %)
Življivost celic v bioreaktorju za kulturo celic kaže nelinearno odzivanje na raztopljeni kisik (DO) in se pri določenih pragovih zelo zmanjša. Dokazano je bilo, da pri zasičenju z zrakom pod 50 % življivost celic znatno upade; pri 30 % zasičenja z zrakom znaša življivost 22 % v primerjavi z 50 % zasičenjem z zrakom (Hanson et al., 2022). Poleg tega povečanje DO od 50 % do 70 % zasičenja z zrakom povzroči zanemarljive povečanja življivosti – poročano povečanje življivosti celic je manj kot 5 % – hkrati pa pride do sočasnega povečanja oksidativnega stresa. To nakazuje, da obstaja ozko optimalno okno zasičenja z zrakom med 40 % in 60 %, kjer se doseže najvišja življivost celic ob minimalnem tveganju metabolnega neravnovesja.
Nastavljena vrednost DO – Relativna življivost – Metabolni vpliv
30 % ⬇️ 78 % Hudo hipoksija, izčrpavanje ATP-ja
50 % ⬆️ 95–100 % Uravnovešeno dihanje
70 % ⬇️ 92–97 % Povišana raven ROS, fragmentacija DNK
Če ostane raven raztopljenega kisika (DO) v ciljnem optimalnem obsegu 40–60 %, se s tem prepreči energetska kriza in škoda, povzročena s prostimi radikali.
Fiziološka osnova: DO, ki imitira hipoksijo (4–10 % O₂)
Ravni DO, ki imitirajo hipoksijo pri 4–10 % O₂ (8–20 % zasičenja z zrakom), so enakovredne koncentracijam kisika, ki so prisotne v tkivih. Aktivirani so hipoksija-inducibilni faktorji (HIF-i) in spremenjeno je celično presnovno delovanje, kar izboljša glikolitične in antioksidativne funkcije ter zmanjša raven reaktivnih kisikovih vrst (ROS) za 40 % v primerjavi z normoksičnim stanjem (Semenza et al., 2021). Ključno je, da je mitohondrijsko dihanje v celoti ohranjeno, kar izboljša življivost in presnovno delovanje celic ter zniža ravni mlečne kisline. Rezultat je metabolna ravnovesja, pri katerem ustreza količina dobavljenega kisika potrebam celic, s čimer se prepreči smrt celic zaradi hipoksije in smrt celic zaradi hipooksije.
Strategije za zaznavno nadzorovanje raztopljenega kisika (DO):\n\nSenzorji za DO: optični nasproti polarografskim\n\nOptični senzorji zanesljivo merijo koncentracijo raztopljenega kisika (DO) z natančnostjo ±1 % zasičenja z zrakom, pri čemer je zdrift in potreba po kalibraciji minimalna. Polarografski sondi ostajata cenejša, a manj zanesljiva možnost, saj se njun zdrift giblje med 2 % in 5 % ter zahtevata ponovno kalibracijo za 50 % pogosteje. Te ponovne kalibracije predstavljajo visoko tveganje kontaminacije, saj se pogosto izgubi hranilna sredstva, kar povzroči zmanjšanje življivosti celic za 15 %. Senzorji za DO so se izkazali kot zanesljivi in podpirajo nadzor DO, ki je ključnega pomena za ohranitev integritete dragocenih celičnih linij v nadzorovanih bioprocesih.\n\nZaprta zanka nadzora: nadzor DO + pretok plina\n\nNadzor DO se bo nadaljevalo prilagajati ob razvoju bioprocesov. Industrijski standard PID-nadzor omogoča hitre spremembe v koncentraciji DO. Izboljšave v hitrosti in natančnosti nadzora so opazne tudi v fazah eksponentnega rasti, ko raven biomase določa željeno vrednost DO. Biotech Control Journal (2023) navaja trojni povečan prenos kisika, če ostale parametre ohranimo konstantne, pri čemer se življivost zmanjša za manj kot 5 %.
Maksimizacija učinkovitosti prenosa kisika: optimizacija KLa v bioreaktorjih za gojenje celic
Vpliv hitrosti nihanja, kota in napolnitve na prenos mase in življivost v enkratno uporabljivih bioreaktorjih
Pri enkratno uporabljivih bioreaktorjih za gojenje celic se KLa (volumetrični koeficient prenosa mase kisika v tekočini) določa na podlagi dinamike nihanja namesto mešanja. Hitrost nihanja, kot in prostornina napolnitve vplivajo na oskrbo tekočine z kisikom ter mehanske napetosti, ki jih celice izkušajo, na ne-linearen način.
- Povečanje hitrosti nihanja povzroči eksponenten naraščaj KLa in s tem tudi oskrbo z kisikom zaradi povečane aerenacije površine. Vendar pri hitrostih nad 25 vrt/min hidrodinamski strižni stres povzroči izgubo življivosti celic (15–30 %) pri celičnih linijah, ki so občutljive na strižne sile.
- Večji kot nihanja (7°–12°) poveča tudi površino med plinom in tekočino. To povečanje pa zahteva strogo nadzorovanje prostornine polnjenja, saj prekomerno polnjenje (> 40 %) zavira obnavljanje površine, podpolnjenost (< 20 %) pa poveča mehanske napetosti na celice.
- Empirične študije kažejo, da kot nihanja 15°–20° pri hitrosti 15–20 vrt/min v kombinaciji s prostornino polnjenja 30–35 % dosledno zagotavlja vrednosti KLa med 4 in 10 h⁻¹ ter ohranja življivost celic nad 90 %.
Opomba: majhne spremembe zahtevajo večje korektivne ukrepe. Na primer zmanjšanje prostornine polnjenja za 10 % zahteva povečanje hitrosti nihanja za 5–8 %, da se doseže enaka vrednost KLa.
Neskladnost ima neposredne stroškovne posledice; raziskava Inštituta Ponemon iz leta 2023 je poročala o povprečni izgubi 740.000 USD na serijo zaradi odpovedi, povezanih z neoptimalno optimizacijo KLa.
Pogosto zastavljena vprašanja
V: Kakšna je optimalna koncentracija raztopljenega kisika za življivost celic v bioreaktorju?
A: Optimalna raven raztopljenega kisika v bioreaktorju je 40–60 % zasičenja z zrakom. Vrednosti nad 60 % lahko povzročijo smrt celic zaradi nastanka prekomernih
V: Kako se prednosti optičnih senzorjev primerjajo s prednostmi polarografskih sond za spremljanje raztopljenega kisika?
A: Pri primerjavi spremljanja raztopljenega kisika z obema metodama so optični senzorji veliko učinkovitejši. Njihova merilna natančnost znaša manj kot 1 %, drift pa približno 0,5 % na mesec. Poleg tega jih je treba kalibrirati vsakih 6 mesecev. Optični senzorji so sicer dražji. Drift polarografskih sond pa znaša približno 2–5 % na mesec in jih je treba ponovno kalibrirati vsak teden.
V: Zakaj je hitrost nihanja ključnega pomena za enkratne uporabne bioreaktorje?
A: Nihanje enkratno uporabljivih bioreaktorjev je glavna metoda za izboljšanje prenosa mase. Previsoka hitrost nihanja pa lahko povzroči poškodbe celic. To velja še posebej za suspenzijske celice in celične linije, ki so bolj občutljive na strižne sile.
V: Kateri so prednosti kompenzacije OTR s predhodnim nadzorom?
A: Kompenzacija OTR s predhodnim nadzorom je koristna, ker zagotavlja, da ostanejo koncentracije raztopljenega kisika dovolj visoke za neomejen rast celic. Glavna slabost bioreaktorjev je, da se hitrost rasti celic lahko močno spreminja. To pomeni, da lahko koncentracije kisika padejo na nevarne ravni, če ni zadostne oskrbe z kisikom. Z merjenjem mase