Corsi sulla progettazione di bioreattori cellulari adattati alla sensibilità alla sollecitazione meccanica e al tipo cellulare
Bioreattori a bassa sollecitazione meccanica per cellule mammifere e cellule staminali
Le cellule staminali mammaliane e simili sono sensibili ai bioreattori caratterizzati da un’elevata sollecitazione idrodinamica e da un miscelamento aggressivo. Ciò comporta una perdita del 40% della vitalità cellulare a causa della rottura delle membrane indotta dallo stress di taglio in presenza di alte concentrazioni cellulari. Per evitare tale perdita di vitalità, sono stati progettati agitatori marini gonfiabili in grado di generare profili di flusso assiale, poiché forniscono un moto circonferenziale casuale del fluido. I sistemi dotati di agitatori segmentati e perfusi, progettati per sostituire quelli di tipo Rushton, consentono un’espansione delle cellule staminali con una riduzione del 60% dello stress di taglio. Durante la scala-up, la validazione della tolleranza allo stress di taglio elevato è fondamentale e deve essere effettuata identificando con precisione la posizione dei componenti più sollecitati, al fine di evitare zone ad alto stress di taglio e una distribuzione dannosa dello stress all’interno del reattore.
Fermentazione Microbica
Poiché la velocità di trasferimento dell'ossigeno richiesta nella camera è >150, è necessaria una miscelazione turbolenta robusta. A differenza delle colture sensibili al taglio, le colture batteriche e di lievito tollerano il taglio. Le goccioline generate dagli spargers, che creano una colonna ad alta energia di acqua, migliorano la velocità di trasferimento dell'ossigeno del 35%. Se l'input di potenza viene aumentato nella colonna ad alta energia, la temperatura supererà i livelli metateorici; pertanto, si dovrebbe utilizzare un denso setaccio metabolico di goccioline ad alta energia.
Disco a coda di pesce vs turbina Rushton
I dischi a coda di pesce operano quasi in regime laminare e forniscono velocità di taglio inferiori a 1 Pa, condizione ideale per sistemi di cellule mammaliane e staminali, mentre le turbine Rushton garantiscono la massima dissoluzione dell'ossigeno, coerentemente con il sistema ad alto taglio per microrganismi, in contrapposizione al sistema a basso taglio.
In applicazioni ibride come la produzione di cellule CAR-T, le turbine a pale inclinate garantiscono un mescolamento quasi perfetto (efficienza dell’85%) a livelli di taglio accettabili per colture in sospensione sensibili. I modelli in scala ridotta da 3 L prevedono le prestazioni dei bioreattori su scala produttiva; pertanto, i bioreattori Transformer contribuiscono allo sviluppo del processo con certezza.
Nella scelta del tipo di bioreattore per una determinata scala e applicazione, considerare la normativa applicabile:
Bioreattori agitati conformi, scalabili e certificati per la produzione di anticorpi monoclonali (mAb) e vaccini
I bioreattori a vasca agitata (STR) sono l'opzione preferita per la produzione su larga scala di prodotti biologici, essendo ben adattati alle normative e comprovati per quanto riguarda la scalabilità. Il loro design modulare consente l'ampliamento della scala produttiva mantenendo livelli ottimali di ossigeno disciolto, pH e nutrienti per la produzione di anticorpi monoclonali (mAb) e vaccini secondo le Buone Pratiche di Produzione (GMP). Un ulteriore vantaggio degli STR è la possibilità di raggiungere elevate densità cellulari in colture in sospensione (superiori a 20 milioni di cellule/mL); inoltre, il mescolamento uniforme ottenuto grazie al sistema di agitazione a elica degli STR garantisce condizioni omogenee nel reattore. La natura meccanicamente complessa degli STR richiede che i sistemi STR vengano convalidati, inclusi i processi di aerazione e regolazione dell’idrogeno, al fine di rispettare le normative FDA ed EMA.
Scelta della migliore alternativa di bioreattore: bioreattori a onda, ad aria sollevata e a letto fisso per colture specializzate
I bioreattori a onda, ad aria sollevata e a letto fisso offrono specifici vantaggi in applicazioni specializzate:
I bioreattori a sacco agitati con onde forniscono un movimento oscillatorio per la sospensione a basso taglio, ideali per l'ampliamento del ceppo di partenza, sebbene esistano limitazioni progettuali legate alla scalabilità, che risulta limitata a circa 500 L.
I bioreattori ad aria sollevata sono energeticamente efficienti per fermentazioni microbiche ad alto tasso di trasferimento di ossigeno (OTR), ma presentano limitazioni nella scala-up a causa di vincoli progettuali.
I bioreattori a letto fisso sono sistemi in grado di raggiungere densità cellulari ultra-elevate, grazie a vari sistemi di coltura su matrice supportata; tuttavia, a causa della complessità della raccolta cellulare, i costi operativi e le difficoltà di processo risultano aumentati.
Prioritizzare i parametri critici del processo rispetto alle funzionalità di automazione
Ossigeno disciolto, pH, temperatura e controllo dei nutrienti come criteri essenziali per la selezione del bioreattore
La selezione del bioreattore deve privilegiare il controllo dei Parametri Critici di Processo (CPP), come l’ossigeno disciolto (DO), il pH, la temperatura e l’alimentazione di nutrienti, rispetto a funzionalità sofisticate dal punto di vista dell’automazione. Mantenere l’ossigeno disciolto entro ristretti limiti fisiologici favorisce le colture aerobiche, nonché la crescita e la vitalità delle cellule, contribuendo alla loro conservazione ed evitando effetti negativi sui rispettivi interessi. Per garantire la conformazione e la fedeltà dell’apoptosi o dell’arresto metabolico, il pH proteasico deve rimanere nei valori medi. Il controllo della temperatura e quello del pH devono essere mantenuti in un rigoroso regime di regolazione. Il controllo in tempo reale dei nutrienti deve restare entro i limiti imposti dall’accumulo di metaboliti inibitori. L’automazione di questi processi non compromette l’efficienza operativa tanto quanto il controllo e il bilanciamento dei quattro CPP. Con un controllo sofisticato e ben bilanciato, la perdita operativa per singolo lotto incidentale ammonta a 500.000–2 milioni di dollari USA (BioPlan Associates, 2023). Prima di considerare l’automazione, i macrosensori prioritari da includere devono essere sensori ottici per l’ossigeno disciolto, piuttosto che i corrispondenti sensori polarografici, in assenza di un sistema di regolazione.
Qual è l'importanza di abbinare il design di un bioreattore al tipo di cellule e alla loro sensibilità al taglio?
Abbinare il design di un bioreattore al tipo di cellule e alla loro sensibilità al taglio è fondamentale per ottimizzare la crescita e prevenire la morte cellulare causata da elevati sforzi di taglio.
Come fanno i bioreattori a soddisfare le elevate esigenze di ossigeno nella fermentazione microbica?
I bioreattori, come le turbine Rushton, aumentano il trasferimento di ossigeno verso le cellule microbiche sfruttando una pompa di ricircolo interna.
Quali sono i vantaggi e gli svantaggi delle turbine a disco idrofoil e delle turbine Rushton?
I dischi idrofoil generano un flusso a minor taglio, mentre i dischi delle turbine Rushton favoriscono il miglior scioglimento di ossigeno, risultando adatti ai sistemi microbici.
Perché i bioreattori a vasca agitata rappresentano l’opzione migliore per una produzione scalabile e conforme alle norme GMP?
Perché sono facilmente scalabili, consentono un controllo preciso dei parametri e sono conformi alle normative FDA ed EMA.
Quali fattori sono più importanti nella selezione di un bioreattore?
I principali fattori su cui concentrarsi, escludendo l'automazione, sono i parametri controllati per la gestione del bioreattore, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo: ossigeno disciolto, pH, temperatura e alimentazione dei nutrienti.