Дизайнът на ферментора-биореактора като система за производство на ензими
Дизайн на ферментора, производство на ензими и качество на ензимите
Формата на съда е особено важна за проектирането на ферментори поради влиянието ѝ върху контрола на вътрешната среда на ферментора, което има значение за синтеза на целевите ензими. От гледна точка на съотношението между височина и диаметър на съда, по-високият съд е по-предпочитан, тъй като може да повиши нивата на разтворен кислород за микроорганизмите, които изискват значителни количества кислород, до 30 процента. Материалът на съда също е важен за цялостността на крайния продукт. Повечето пластмаси отделят своите химически вещества и ензими, докато боросиликатното стъкло е по-малко склонно към това. Правилният избор на турбинна месителна перка може да е критичен за смесването. Например стандартната турбина на Ръштън може да осигури равномерност на смесването от 95 % за по-малко от 10 секунди, дори при много вискозни бульони. За оптималното производство на чувствителни ензими като липази и протеази е необходимо внимателно регулиране на температурата, за да се поддържа температурата на ферментора в рамките на ±0,5 °C. При наличието на необходимите системи за контрол съвременните ферментори с автоматично подаване на хранителни вещества, базирано на pH, могат да поддържат добива в рамките на 2 %, което е оптимално за производството на целевите ензими. Внимателното разполагане на датчиците за прегради, за да се избегнат мъртви зони, ще помогне за елиминиране на натрупването на материали, които неблагоприятно влияят върху качеството на целевите ензими.
Аерация, смесване и управление на напрежението при срязване в потопена ферментация.
Добрият потопен ферментационен процес се основава на правилния баланс между скоростта на усвояване на кислород от системата, интензивността на разбъркването и контрола върху свързаните механични напрежения в системата. Излишното срязващо напрежение ще разруши важните мицелни мрежи, докато недостатъчното разбъркване води до зони, лишени от кислород. Порите на разпръсквателя (спарджъра), които обикновено имат размер от 10 до 200 микрона, имат значително значение. По-малките пори осигуряват по-добра дисперсия на газа и течността, но също така предизвикват по-интензивно пянене. При фунгицидната ферментация оптималният диапазон на обемните скорости на масов пренос е между 20 и 150, което съвпада и с диапазона на най-голямата фунгицидна растежна активност. Тези скорости съответстват и на най-големия растеж на фунгицидните мицели, най-големия растеж на фунгицидните мицели, най-големия растеж на фунгицидните мицели, най-големия растеж на фунгицидните мицели и най-големия растеж на фунгицидните мицели. При работа с актиномицети трябва да се проявява особена внимателност, тъй като те са изключително крехки при скорости на върха на перката, надвишаващи 2,5 м/сек. В противоположност на това, штамовете от рода Bacillus развиват най-добра активност при турбулентни условия на течността с използване на препятствия (бейфъли), но без образуване на разрушителни вихри. Сред последните иновации в проектирането на производствени обекти е прилагането на компютърна хидродинамика за идентифициране на зони с механично напрежение и проектиране на системи за разбъркване, адаптирани към тези специфични условия. За управление на не-ньютоновото поведение на бульони с високо съдържание на полисахариди са необходими специални коаксиални смесители. Реалновременните измервания на вискозитета позволяват на операторите да коригират входната мощност, за да се поддържа желаният режим на Касонова течност.
Когато става въпрос за контрол на пената, много заводи избират антипенни агенти без силикон, тъй като те се справят с пената, без да нарушават ефективността на аерацията или случайно да премахнат ензими от разтвора.
От лабораторен штам до комерсиален мащаб: интенсификация на процеса, задвижвана от ферментор
Термостабилни ензими: партиден, полуепарционен и непрекъснат ферменторен режим
Избраният тип ферментационен процес има съществено значение за определяне на количеството термостабилни ензими, които могат да се получат, както и за начина, по който процесът се контролира. Макар че системите с партиден режим са най-лесни за контролиране и експлоатация, те са и най-малко продуктивни поради намаляващата продуктивност, която настъпва след експоненциалната фаза на растеж. Този проблем се решава чрез ферментация в режим „фид-батч“ (с подаване на хранителни вещества), при който хранителните вещества се добавят постепенно, за да се поддържа по-висок стационарен добив. Всъщност някои източници от областта на биопроцесите сочат до 30–40 % по-висок добив на термостабилни ензими при използване на метода „фид-батч“ в сравнение с партидния метод. Непрекъснатата ферментация е идеална за ензими, които запазват активността си по-продължително време, като например някои протеази, тъй като осигурява оптимална продуктивност. Недостатъкът ѝ е, че продължителната работа на такива системи обикновено води до повишена честота на контаминация. Следователно повечето производители постигат най-добрия баланс между продуктивност и контрол чрез системи „фид-батч“, тъй като те осигуряват по-продължително непрекъснато производство в сравнение с другите методи и позволяват добър контрол върху скоростта на метаболизма, както и намаляване на риска от контаминирани системи.
Мониторинг в реално време с PAT: Осигуряване на по-добър контрол върху ферменторите и съгласуваност на ензимите
Технологията за аналитичен процес (PAT) осигурява наблюдение в реално време на биокатализаторните ферментационни съдове, включително разтворен кислород, pH, биомаса и концентрации на множество други метаболити. Сензорите и системите за обратна връзка предоставят на операторите незабавни данни, които им позволяват да коригират аерацията, хранителните добавки и разбъркването. Този тип наблюдение и контрол в реално време намалява вариабилността между отделните партиди с около 25 % и подобрява последователността на производствения процес. В случай на субстрати с термостабилни ензими PAT-системите могат да регистрират тънки промени във вискозитета, което показва точния момент на максимална ензимна експресия. Това позволява оптимизиране и максимизиране на добива без излишно използване на ресурси. Освен това автоматизираните системи за обратна връзка следят механичното напрежение (shear stress) и допринасят за запазване на структурната и функционалната цялост на произведените ензими. Най-важното е, че PAT-системите са уникални по това, че събират многобройни данни за управление в мерки, необходими за създаване на затворена контурна система за управление (closed loop control). Това е ключът към последователността на качеството на ензимите, особено при мащабиране на производството, и също така позволява спазването на насоките за добра производствена практика (GMP – Good Manufacturing Practices).
Икономически и регулаторни компромиси при избора на ферментори за производство на ензими в съответствие с GMP
Еднократни срещу неръждаемостомаслени ферментори: съображения относно гъвкавостта, разходите и компромисите в жизнения цикъл
При ферменторите изборът между еднократни и неръждаемостомаслени ферментори изисква балансиране на гарантирането на стерилността, изискванията за мащабируемост и разглеждането на разходите през целия жизнен цикъл в рамките на регулациите GMP.
Стерилност: В еднократните системи не може да има кръстосано замърсяване, тъй като няма цикъл на почистване и стерилизация; обаче трябва да се извърши изчерпателна валидация на полимера относно екстрактуемите и измиваемите вещества. Съдовете от неръждаема стомана разчитат на валидирана SIP (стерилизация на място с пара) и CIP (почистване на място) за контрол върху микробната контаминация.
Мащабируемост: За производството с висока пропусквателна способност са необходими операции по непрекъснато производство в големи обеми, а тук инфраструктурата от неръждаема стомана е от решаващо значение. От друга страна, системите за еднократна употреба са по-добри при гъвкавото производство на множество продукти, където се изискват бързи промени между кампании и по-малко време за подготвка.
Животински цикъл на разходите: Въпреки че ферменторите от неръждаема стомана изискват капиталови инвестиции, които са около 40 % по-високи в сравнение със системите за еднократна употреба, те осигуряват по-ниски експлоатационни разходи на партида след 5 години; при системите за еднократна употреба първоначалните разходи са по-ниски с около 60 %, но разходите за разтребваемите компоненти нарастват бързо — особено при комерсиален мащаб — при затворено партидно производство.
Що се отнася до системите за еднократна употреба, компаниите трябва да управляват документацията за материали в целия производствен процес, за да се извършват изпитания за екстрактуеми вещества, които също са класифицирани според насоките за добра производствена практика (GMP). Металното оборудване също изисква документация, която потвърждава неговата устойчивост към корозия, както и документация, която потвърждава правилното му полиране/довършване. Регулаторните органи също изискват пълна повторна валидация според техните специфични изисквания за инструментите F, E и M, всеки път когато компаниите искат да увеличат капацитета на металното оборудване или да модифицират капацитета му, за да включат системи за еднократна употреба. Очевидно е, че компаниите разбират тези фактори, а онези компании, които провеждат най-добре интегрирани одити на доставчиците и проектират предварително качествени системи с „затворен цикъл“, насочват своите усилия към изискванията на ICH Q5A(R2) и USP 665 относно ограниченията за екстрактуеми и личими вещества (EL) за процесните материали по отношение на контрола и спецификациите.
Често задавани въпроси
Как дизайновото решение на ферментатора влияе върху биосинтезата на ензими?
Ферментаторът позволява прецизен контрол върху околните фактори, които влияят върху добива и качеството на произведените ензими.
Как подводната ферментация може да бъде по-ефективна?
Чрез добре балансиран контрол върху аерацията, разбъркването и приложените стресови фактори. Ефективният контрол върху тези параметри е от съществено значение за постигане на желана вискозитет, който пряко влияе върху производството на ензими.
Какви са разликите между партиден, полу-непрекъснат и непрекъснат режим на работа на ферментатора?
Всички три начина на работа на ферментатора — пълна загрузка (Batch), подхранвана загрузка (Fed-batch) и непрекъсната работа (Continuous) — имат своите предимства. Системите с пълна загрузка са прости, но продуктивността намалява след експоненциалната фаза на растеж. Системите с подхранвана загрузка позволяват добавяне на хранителни вещества и по този начин осигуряват по-високи добиви. Непрекъснатите ферментационни системи осигуряват най-висока ферментационна активност, но носят по-голям риск от контаминация. Системите с подхранвана загрузка изглеждат като оптимален компромис по отношение на продуктивността, макар все още да осигуряват по-голям контрол.
Какво е значението на технологията за аналитичен контрол на процеса (PAT) във връзка с операциите на ферментатора?
Реалновременното наблюдение на параметрите на процеса може да се използва за извършване на необходимите корекции, за да се спазват изискванията на добрата производствена практика (GMP) и да се поддържа необходимото равнище на последователност при производството на ензими.
Какви са предимствата и недостатъците на ферментаторите с единична употреба и на ферментаторите от неръждаема стомана при производството на ензими?
Еднократно използваните ферментори са по-евтини в началото, но всяка партида има по-висока цена в сравнение с ферменторите от неръждаема стомана, които имат по-висока първоначална цена, но стават по-евтини след по-голям брой партиди, освен това позволяват по-голяма мащабируемост за по-икономично производство с висока пропусклателна способност.